嗜酸乳杆菌S-层蛋白对感染大肠杆菌小鼠肠黏膜免疫功能的影响

研究嗜酸乳杆菌S-层蛋白对感染致病性大肠杆菌小鼠肠黏膜免疫的影响。用5 M的氯化锂溶液对嗜酸乳杆菌的S-层蛋白进行提取,获得脱除S-层蛋白的嗜酸乳杆菌菌体。将SPF级BALB/c小鼠随机分为对照组、致病性大肠杆菌感染组、嗜酸乳杆菌预防组治疗组,脱除S-层蛋白的嗜酸乳杆菌预防组和治疗组六组,实验进行14 d。小鼠处死后取眼球血、小肠及肠黏膜,观察各组小鼠肠黏膜形态变化、肠黏膜功能因子表达的差异。致病性大肠杆菌感染组与对照组相比,肠黏膜形态明显改变,感染大肠杆菌的小鼠在灌胃嗜酸乳杆菌后各黏膜SIg A和IL-10含量明显升高,同时血清IFN-γ、TNF-α和IL-1β含量对比感染组有了显著下降,说明可以减缓炎症发生,并且比脱除S-层蛋白的嗜酸乳杆菌治疗组对肠黏膜免疫保护效果好。嗜酸乳杆菌S-层蛋白对于嗜酸乳杆菌定植于肠黏膜并形成生物屏障保护其免疫功能有着重要影响。     

乳酸菌S-层蛋白的多样性及其研究方法

乳酸菌是人体和许多动物肠道的正常菌群,在预防肠道感染、促进人体健康方面,具有不可或缺的作用.乳酸茵通过竞争性黏附来抑制致病茵的繁殖.研究表明,乳酸菌的黏附作用与细胞表层蛋白密切相关.表层蛋白又名S-层蛋白(surface layer protein,Sip),是许多细菌及古生菌细胞壁表面所包被的生物活性大分子,在一些乳酸茵中也发现了S-层蛋白的存在.S-层蛋白的相对分子质量在40 000～200 000间,而在已发现的乳酸菌中,S-层蛋白相对分子质量在25 000～70 000间.作者讨论了乳酸菌中S-层蛋白的多样性及主要特性,对乳酸菌S-层蛋白的研究方法进行了初步探索.     

嗜酸乳杆菌KLDS1.0901表层蛋白对菌株黏附特性的影响

采用体外实验探究了嗜酸乳杆菌KLDS1.0901的浓度、生长阶段、表层蛋白对其黏附Caco-2细胞能力的影响。将未处理、去除表层蛋白和热致死的KLDS1.0901采用荧光标记灌胃给小鼠,取不同部位的肠黏膜,进行流式细胞检测。通过透射电镜和SDS-PAGE对表层蛋白粗品进行分析鉴定。结果表明,随着菌体浓度的增加,KLDS1.0901黏附率增大直至浓度为10⁸ CFU/mL黏附率达到饱和。菌体处于对数生长末期时,黏附特性更优。Caco-2单细胞层与KLDS1.0901表层蛋白共同孵育1 h黏附量显著下降(p<0.05),且加入的表层蛋白浓度越高,对其黏附抑制作用越强。未处理的KLDS1.0901细胞壁外围包裹着表层结构,但除去表层蛋白后表层结构即消失。表层蛋白粗品中表层蛋白含量约为15.6%,分子量在43 kDa左右。综上,嗜酸乳杆菌KLDS1.0901含有丰富的表层蛋白,且能较好的黏附于小鼠肠道,具有益生菌的潜力。     

乳源短乳杆菌M8 S- 层蛋白的提纯及其生物学特征分析

通过利用原子力显微镜(AFM)来观察凝胶过滤层析法提纯短乳杆菌M8菌株的S-层蛋白的表面形貌,同时探讨S-层蛋白的再生特性及黏附特性。结果表明：凝胶过滤层析法能够获得纯度较高的S-层蛋白;该蛋白在纯水中可自我组装成纳米级“团簇”结构;去除S-层蛋白的菌体细胞仍然具有生命活性,适当培养后可重新表达该蛋白;短乳杆菌M8可黏附到Caco-2细胞上,其S-层蛋白介导此过程。     

乳酸菌S-层蛋白的功能特性及在微生态制剂中的应用

S-层蛋白(surface layer protein,slp)是一些乳酸菌,细菌及古细菌细胞壁表面所包被的生物活性大分子。这些蛋白能够形成周期性的有序结构,如倾斜形,正方形或是匀称的六边形。最新研究表明,这些结构是通过非共价键相互作用,在熵驱动下自我组装而成。与其他S-层蛋白相比,乳酸菌S-层蛋白的显著特点是分子质量小、等电点高。一些乳酸菌含有多种S-层蛋白编码基因,他们能够分别或同时表达。随后,文中介绍了3种乳酸菌S-层蛋白的分离方法。最后简单介绍了乳酸菌S-层蛋白在益生菌微生态制剂中的的应用。     

嗜酸乳杆菌S-层蛋白的提取和鉴定

采用高浓度溶剂法(氯化锂/盐酸胍)及溶菌酶结合氯化锂法提取3株乳酸杆菌的表层粗蛋白,通过SDSPAGE比较不同方法及菌株的蛋白提取效果。对嗜酸乳杆菌CGMCC 1.1878表层粗蛋白进行凝胶过滤层析纯化后,采用MALDI-TOF-TOF对纯化的蛋白进行二级质谱鉴定,用扫描电镜观察蛋白表面形态。结果表明:高浓度溶剂法提取的蛋白条带多集中在40~60 ku,其中,氯化锂溶剂所提蛋白特征条带明显,便于纯化及分析。根据MASCOT软件搜索及NCBInr数据库比对,成功鉴定出该纯化蛋白为嗜酸乳杆菌S层蛋白,分子质量为46 ku。     

乳酸杆菌S-层蛋白的结构及免疫调控功能研究进展

本文综述了乳酸杆菌S-层蛋白的结构及功能,包括S-层蛋白对胆盐及消化酶的耐受能力、参与乳酸杆菌对宿主的黏附作用、抑制病原菌对宿主细胞的黏附及侵入作用。并且详细阐述了S-层蛋白对细胞信号通路的调节功能,证明S-层蛋白对于乳酸杆菌发挥免疫调节功能具有重要的作用。     

嗜酸乳杆菌NCFM黏附定植能力的研究

采用实时定量(Real-time)PCR的方法对嗜酸乳杆菌NCFM在小鼠肠道中的定植情况进行了评价。通过研究发现,实时定量(Real-time)PCR用来菌数的评估具有非常好的线性关系和稳定性。小鼠灌胃一周的过程中,在小鼠的十二指肠、回肠、空肠、盲肠、结肠和粪便中菌体的数量并没有出现数量级上的增长或减少,说明我们灌胃的菌体浓度适当,并没有引起小鼠体内的菌群失调。而在灌胃第1 d,基本上各部分的肠组织和粪便中菌体的数量都有增加,说明灌胃初期菌体在肠道中有较好的定植。而第3、5和7 d小鼠肠道和粪便中的菌体数量上下波动,但并没有显著地增加或减少,说明小鼠体内的菌群数量达到了一个平衡,并不会因为持续灌胃就打破这个平衡。因此,嗜酸乳杆菌NCFM具有良好的定植能力。     

富含S-层蛋白乳酸菌的鉴定及其消化酶耐受性研究

通过平板划线分离法从新鲜牛奶中筛选获得一株乳酸菌菌株,命名为M8,SDS-PAGE分析该菌株富含S-层蛋白。结合表型特征、生理生化特征与16S rRNA基因序列分析法,鉴定该菌株为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。对其人工消化液耐受性分析,结果显示:其对人工胃液(3.0g/L,pH2.5)具有良好耐受能力,能在人工肠液(10g/L,pH8.0)中增殖,且S-层蛋白具有耐消化酶酶解能力。提示S-层蛋白作为保护屏障,可抵抗消化酶的作用。     

乳酸菌S-层蛋白及其黏附性相关研究技术

乳酸菌为人体的重要生理性细菌,在维持人体肠道生态环境、提高机体免疫力等方面起到重要的作用。然而,乳酸菌发挥这些生理功能的重要前提是黏附到肠细胞的表面。随着研究的深入,越来越多的研究表明乳酸菌S-层蛋白对宿主细胞具有黏附性,如罗伊氏乳酸菌S-层蛋白可与黏蛋白及人结肠癌细胞HT-29进行黏附。在研究乳酸菌S-层蛋白对宿主细胞的黏附时,人们采用了不同的方法。一些常用的基本方法有SDS-PAGE、层析纯化技术、显微镜观察技术等。随着新技术的应用,表面等离子共振技术、免疫学技术等也用于研究S-层蛋白的黏附性。本文将着重介绍S-层蛋白及S-层蛋白黏附性研究的相关技术。     

植物乳杆菌表面性质及对Caco-2细胞的黏附

通过对10 株不同来源的植物乳杆菌进行自聚集能力、表面疏水性以及体外黏附Caco-2细胞能力的测定,探究植物乳杆菌表面性质与黏附能力之间的关系,利用LiCl对植物乳杆菌进行处理,探究参与植物乳杆菌对细胞黏附过程的物质。结果表明：植物乳杆菌3-4对Caco-2细胞的黏附能力最强。所选的不同植物乳杆菌之间自聚集能力、表面疏水性以及对Caco-2细胞的黏附能力存在差异性;对细胞的黏附能力与表面疏水性存在着显著的相关性（P＜0.05）,因此,自聚集能力和疏水性可以作为筛选具有高黏附细胞能力的植物乳杆菌的参考指标。同时LiCl处理前后,植物乳杆菌自聚集能力和对细胞的黏附能力均有所下降,表明菌株表面蛋白类物质及其他大分子物质均参与自聚集和黏附过程。     

乳清蛋白酶解物促嗜酸乳杆菌增殖作用研究

利用胃蛋白酶水解乳清蛋白,获得酶解产物的优化工艺条件是pH 值为2.2,水解温度为65℃,底物质量浓度为2g/100mL,酶与底物比为7%,其蛋白水解度为12.51%。乳清蛋白水解物与经过超滤和凝胶过滤后的分离物对嗜酸乳杆菌B 有较好的增殖作用,其中分子量1000D 以下的酶解产物增殖效果最为显著。质谱分析证实该段水解产物是分子量集中在213.2～956.9D 之间的寡肽和氨基酸复合物,可使嗜酸乳杆菌B 活细胞数量提高一个对数级。显然,应用廉价乳清蛋白水解产物作为培养基质可以提高嗜酸乳杆菌B 的细胞数量。     

桑叶浸出液抑制MDA-MB-231细胞增殖和抑制Survivin蛋白表达

为了研究桑叶浸出液对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和对凋亡抑制蛋白Survivin的作用。本实验采用体外培养MDA-MB-231细胞,倒置显微镜观察桑叶浸出液作用后细胞形态变化;CCK-8法检测桑叶浸出液对MDA-MB-231细胞增殖的影响;流式细胞仪分析桑叶浸出液对MDA-MB-231细胞凋亡及周期的影响;Western Blot印迹法检测桑叶浸出液对凋亡抑制蛋白Survivin表达的影响。结果表明桑叶浸出液会引起MDA-MB-231生长形态的变化,抑制细胞增殖,增加细胞凋亡数量,且在桑叶浸出液作用后MDA-MB-231细胞的G0/G1期细胞明显高于正常组(p<0.05),同时桑叶浸出液降低凋亡抑制蛋白Survivin的表达,且表达量随着桑叶浸出液浓度的升高而降低。研究表明,桑叶浸出液能够抑制MDA-MB-231细胞的增殖,促进细胞凋亡及导致G0/G1期阻滞,同时能够降低凋亡抑制蛋白Survivin的表达。     

嗜酸乳杆菌胞外蛋白的分离纯化及抑制HT-29细胞增殖作用的研究

为探讨嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)分泌的相关蛋白质及其促进肠道稳态的功能作用,本研究以L.acidophilus作为研究对象,固体培养获得胞外蛋白粗提液,采用Sephadex G-100凝胶层析纯化,收集胞外蛋白各组分,用考马斯亮蓝法和SDS-PAGE方法分别测定各蛋白组分的含量及分子量,然后采用四氮唑蓝比色分析法(MTT法)鉴定各蛋白组分抑制HT-29细胞增殖的能力。研究显示,分离L.acidophilus胞外蛋白获得两个蛋白峰,分子量分别为67 ku和37 ku,含量分别为0.066 mg/m L和0.021mg/m L,不同浓度(0.001μg/m L、0.01μg/m L、0.1μg/m L和1μg/m L)的67 ku和37 ku胞外蛋白分别对HT-29细胞作用12 h、24 h、48 h和72 h,均显示抑制细胞增殖的作用,且呈现明显的量效关系和时间依赖效应,其中1μg/m L的67 ku和37 ku胞外蛋白对HT-29细胞作用48 h的抑制率分别为(38.41±1.94)%和(45.06±1.58)%。综上所述,固体培养L.acidophilus可获得两种胞外蛋白(即37 ku和67 ku),其对HT-29细胞增殖具有不同程度的抑制作用,其中37 ku胞外蛋白的抑制作用较强。     

乳杆菌耐消化应激能力及消化应激对其肠道黏附能力的影响

首先通过体外模拟唾液-胃液-肠液应激实验研究乳杆菌的耐消化应激能力,然后研究其对肠道黏蛋白和Caco-2细胞的黏附及抑制肠道病原菌黏附的能力,最后探讨消化应激对乳杆菌黏附能力的影响。结果表明,副干酪乳杆菌W125、m111和发酵乳杆菌146在依次经过模拟唾液-胃液-肠液应激后存活率分别为2.70%、3.53%及11.15%,活菌数分别为7.46、7.24(lg(CFU/mL))及8.35(lg(CFU/mL)),且对黏蛋白和Caco-2细胞的黏附率显著高于其他菌株（P<0.05）,分别为15.67%、8.75%、8.38%和11.47%、21.34%、10.44%;3株菌株均可通过排除、竞争和替代的方式抑制大肠杆菌CICC10899和沙门菌WX29对肠道的黏附,黏附抑制率均大于13.51%;消化应激显著降低了副干酪乳杆菌W125和发酵乳杆菌146对肠道的黏附能力（P<0.05）,但显著增加了副干酪乳杆菌m111的黏附能力（P<0.05）,黏附率由17.60%增加到30.45%,且主要黏附素由消化应激前的表层蛋白变为应激后的蛋白和多糖;消化应激前后副干酪乳杆菌m111均...     

呕吐毒素对HK2细胞增殖及诱导凋亡蛋白表达的调节作用

该研究探究了呕吐毒素抑制HK2细胞的增殖与诱导凋亡蛋白表达作用。不同浓度的呕吐毒素作用于HK2细胞后,采用MTT法检测呕吐毒素对细胞增殖的抑制作用,通过荧光显微镜观察细胞形态学的变化,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化,采用Western bloting法检测凋亡蛋白Bax、bcl-2、NF-KB、Caspase-2、3、6、8、9的表达水平。研究结果表明,呕吐毒素可显著抑制HK2细胞的增殖,具有明显的量效关系,15、30、40、60和80 μmol/L的呕吐毒素对HK2细胞的抑制率分别为61.82%、53.64%、42.43%、38.66%和36.54%;30 μmol/L的呕吐毒素处理HK2细胞0、12、24、48、72和96 h后,细胞的存活率分别为99.84%、80.51%、60.25%、52.22%、62.50%和71.34%。15、40和80 μmol/L的呕吐毒素处理细胞24 h后,细胞的凋亡率分别为2.30%、30.20%和53.50%。Western bloting结果显示呕吐毒素可上调Bax、Caspase-2、3、6、8、9蛋白表达,抑制了bcl-2和NF-KB的蛋白表达。结果表明,呕吐毒素对HK2细胞的增殖有明显的抑制作用,使得细胞发生凋亡,同时对凋亡蛋白的表达具有一定的调节作用。     

Effect of Low pH on the Ability of Lactobacillus acidophilus to Survive and Adhere to Human Intestinal Cells

Lactobacillus acidophilus was suspended in broth and buffer at pH 2, 3 and 4 and incubated at 37°C for 2 hr. In both broth and buffer pH 2, viable cell numbers decreased rapidly, and none were recovered after 45 min. At pH 4 in broth and buffer, the number of cells was not significantly reduced in 2 hr. In potassium phthalate buffer at p 3, no viable cells were recovered after 30 min, while in KCl buff and broth at pH 3, no significant reduction was seen. Cells subjected to low pH for up to 5 h were able to adhere to human intestinal cells in vitro. Exposure to low pH did not appear to disrupt the ruthenium red staining layer exterior to the cell wall.