原核表达重组牛凝乳酶原及重组牛凝乳酶酶学特性

凝乳酶能够专一性裂解κ-酪蛋白,是制造干酪的关键酶。运用大肠杆菌表达系统对牛凝乳酶原进行了原核表达和初步纯化,活化重组凝乳酶原及测定凝乳活性,对重组凝乳酶的酶学特性进行分析。结果表明:大肠杆菌表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的66.3%,每升培养液可纯化约200 mg的重组凝乳酶原,活化后的凝乳酶活力可达600 000 SU/g。经测定凝乳酶最适作用温度为57⁶2℃,并在pH 262℃,并在pH 2⁷、低于40℃的温度范围内稳定。金属离子中Al3+,Fe3+和Cu2+能显著增强酶活;胃蛋白酶抑制剂pepstatin A对酶有明显的抑制作用。     

原核表达重组牛凝乳酶的纯化

原核表达获得的重组牛凝乳酶与商品重组牛凝乳酶有相似的酶学特性,具商业潜力,故进一步研究其纯化方法。使用离心与饱和硫酸铵沉淀,成功纯化出有活性的重组牛凝乳酶。蛋白最终回收率为1.82%,总活力比纯化前提高了73.3%,比活力提高了95.3倍。同时,讨论了如何提高包涵体复性率与产物回收率,为今后该酶的工业化生产提供技术参考。     

甲醇芽孢杆菌凝乳酶对马苏里拉干酪加工特性的影响

为了探究甲醇芽孢杆菌（Bacillus methanolicus）凝乳酶在马苏里拉干酪加工中的应用,分别以使用甲醇芽孢杆菌凝乳酶、混合酶制剂（含质量分数10%甲醇芽孢杆菌凝乳酶和90%商品凝乳酶）制作的马苏里拉干酪作为实验组,以商品凝乳酶干酪作为对照组,测定不同组别干酪成熟期间的蛋白水解特性、质构、风味和微观结构变化,研究甲醇芽孢杆菌凝乳酶对马苏里拉干酪加工特性的影响。结果表明,实验组干酪在成熟过程中pH值（4.6～5.3）、微生物数量（8.80～9.68（lg（CFU/g）））与对照组无显著差异（P＞0.05）;实验组干酪水分质量分数（混合酶干酪为（43.21±1.17）%、甲醇芽孢杆菌凝乳酶干酪为（46.15±0.94）%）均显著高于对照组（（41.08±1.04）%）,得率（混合酶干酪为（9.27±0.17）%、甲醇芽孢杆菌凝乳酶干酪为（9.46±0.16）%）也显著高于对照组（（8.98±0.13）%）（P＜0.05）;且实验组干酪的蛋白水解特性（pH 4.6时可溶性蛋白、酪蛋白水解程度和游离氨基酸质量分数）以及风味物质种类和相对含量等指标也优于对照组干酪。但是实验组中甲醇芽孢杆菌凝乳酶干酪保形性相对欠佳,感官评定得分偏低,混合酶干酪与对照组质构及感官基本得分一致,因此甲醇芽孢杆菌凝乳酶可以作为商品酶的部分代替品应用于干酪的生产中。     

牛凝乳酶全长cDNA的克隆及其原核表达载体的构建

从小牛皱胃中提取凝乳酶(Chymosin)总RNA,经过RT-PCR获得凝乳酶cDNA,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶全长基因序列。序列测定表明,凝乳酶全长核苷酸长度为1 143 bp,编码381个氨基酸。与GenBank上已发表序列NM_180994进行比较,核苷酸同源性为99.56%。将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b/Chymosin,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为凝乳酶的进一步表达奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌克隆与表达微小毛霉凝乳酶基因

从自制的酒酿利用酪蛋白培养基分离纯化到了一株产凝乳酶的微小毛霉菌株（ZZMZ-19）,从ZZM-19菌株的cDNA文库筛选到了两个凝乳酶基因chl和ch2并实现了凝乳酶基因ch1和ch2在枯草芽孢杆菌菌株（ZZMZ-01）中的的克隆与表达。chl和曲2阳性克隆菌株在酪蛋白培养基r1]发酵30h左右的时间凝乳酶酶活达到最人,分别为48．27SU／mL和41．02SU／mL,相比出发菌株发酵时间缩短了15h。用交联葡聚糖凝胶柱G100分离纯化其发酵卜清液后,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测得CHII和cHIII分子草分别为32ku和30ku。     

枯草芽孢杆菌PNG27生产凝乳酶的发酵工艺优化及分离纯化研究

通过单因素试验、Plackett-Burman试验设计、Box-Behnken响应面试验设计对培养基成分及发酵条件进行了优化,使最终发酵液凝乳酶活力达到222.34±4.99 U/m L。采用乙醇分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换柱层析和Sephadex G-100分子筛等分离手段对枯草芽孢杆菌PNG27凝乳酶进行分离纯化,得到电泳纯的凝乳酶。结果表明,酶的比活力达到794.30 U/mg,纯化倍数为8.29倍,最终回收率为4.25%,SDS-PAGE电泳分析凝乳酶分子质量约为42 k Da。     

原核表达抗克伦特罗重组单链抗体及其纯化研究

目的:原核表达抗克伦特罗重组单链抗体,对表达的包涵体蛋白进行提取和纯化,并鏊定重组抗体特性.方法:通过温度诱导大肠杆菌表达抗克伦特罗单链抗体,超声破碎菌体细胞,采用不同洗涤溶液提取包涵体.以不同变性剂溶解包涵体,Ni-NTA亲和柱纯化后,经脉冲稀释法将其复性.超滤及透析浓缩蛋白复性液,经Ni-NTA亲和柱二次纯化,得到纯化重组目的蛋白.通过SDS-PAGE电泳分析重组目的蛋白纯度,采用Western bloning和间接竞争EUSA对所制备的抗克伦特罗重组单链抗体特异性进行鉴定.结果:以大肠杆菌Es-cherichia coli BL21(DE3)为宿主菌诱导表达重组单链抗体,产率最高,占菌体蛋白的31%.以1 mol/L尿素洗涤包涵体,6 mol/L盐酸胍为变性剂,经Ni-NTA亲和柱纯化,所得复性重组单链抗体蛋白的纯度达96%.Western blotting分析显示,纯化并复性后的单链抗体可与鼠抗His标签蛋白单克隆抗体发生特异性的结合反应.间接竞争ELSIA结果表明,该重组抗体IC50值为3.35 ng/mL,与沙丁胺醇等结构类似物无交叉反应.结论:原核表达制备的抗克伦特罗重组单链抗体具有较好的抗原结合活性及特异性,为进一步开展克伦特罗的免疫快速检测研究奠定基础.     

根霉凝乳酶的分离纯化及其酶学特性研究

采用70%乙醇对凝乳酶进行粗提,回收率为52.65%.采用DE-52和Sephadex G-75柱进行纯化,经冷冻干燥成酶粉,其活力1813.74 U/mg,回收率为11.25%.该酶的最适反应pH为5.7,在pH 5～7.5范围酶活力保持稳定;最适反应温度45℃,60℃保持20min,酶完全失活.Ca2+、Fe2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Al3+对该酶的活力有不同程度的促进作用,其中以Al3+和Ca2+的促进作用最显著,Na+和K+对该酶的活力有抑制作用.通过SDS-PAGE测定,该酶的分子质量约35kDa.     

牛凝乳酶原基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特性的研究

凝乳酶是制造干酪的关键酶。为获得高活性的牛凝乳酶（chymosin,B-chy）,用电脉冲法将线性化的pGAPZαA-B-pchy重组表达载体转化到毕赤酵母GS115中。该菌株在以葡萄糖为碳源的YPD培养基中可分泌表达牛凝乳酶原。SDS-PAGE分析表明所表达的牛凝乳酶,分子量约为37ku,符合预期大小。发酵培养96h后,酶活力达到96SU/mL。酶学特性分析表明,其最适凝乳温度为60℃,在pH2⁶、小于50℃的温度范围内稳定。Ca2+浓度为40mmol/L时,钙促酶反应活性达到最高,此后随着Ca2+浓度的增加酶活力逐渐降低。金属离子Al3+、Mn2+、Fe2+、Mg2+和K+对酶活力具有显著的促进作用,而Co2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+对酶活力具有显著的抑制作用。本研究优化了凝乳酶的表达条件,为凝乳酶工业化生产提供了理论基础。      

解淀粉芽孢杆菌GSBa-1凝乳酶的生产及其酶学性质研究

采用正交试验设计优化了解淀粉芽孢杆菌GSBa-1发酵产凝乳酶的工艺条件:发酵温度35℃,装液量40%,摇床转速180 r/min,发酵时间84 h。在此优化条件下,获得的凝乳酶凝乳活力为558.14 Su/m L。进一步研究了该酶的酶学性质,凝乳酶最适反应温度为55℃,酶活力在25~45℃比较稳定,60℃保持50 min完全失活。在p H5.5时凝乳酶活力最高,在pH 5.5~7.0范围内,随着pH增大,凝乳酶活力逐渐下降,p H 6.5时,凝乳酶活力稳定性最高。Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)以及Al~(3+)均对凝乳酶的凝乳活力有促进作用,其中Ca~(2+)对凝乳活力的促进作用最为显著,且Ca~(2+)浓度为0.020 mol/L时凝乳酶的凝乳活力达到最大值,而Na~+、K~+和Cu~(2+)对凝乳活力均有抑制作用;凝乳酶Km为2.35 g/L,Vmax=1.18 U/m L。     

Bacillus sp.CBB272脱枝酶的酶学性质

脱枝酶是淀粉加工过程中水解其1,6-糖苷键的水解酶,为淀粉彻底糖化所必需。作者从高温菌Bacillus sp.CBB272的培养液中,经过盐析、凝胶过滤层析、弱阴离子交换层析以及强阴离子交换层析联用的方法,纯化出一种新型脱枝酶。该酶在SDS-PAGE上的相对分子质量约为70 000,最适作用温度为70℃,最适作用pH为6.0。该酶在30~70℃、pH 4.5~9.0之间具有优良的稳定性。该酶在50℃和pH 6.0下水解支链淀粉的Km、Vmax分别为4.0324 mg/mL和0.1841 mg/(min.mL)。研究了不同金属离子对该酶活性和热稳定性的影响,发现Ca2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对于该酶具有显著的激活效果,并且Ca2+对该酶的热稳定性具有很好的提升作用。     

赭曲霉毒素A降解酶Af-OTd的酶学性质分析

赭曲霉毒素A(OTA)是一种广泛分布在食品中的真菌毒素,减少或脱除食品及其原料中的赭曲霉毒素A,对提高食品质量、保障国民食品安全具有重要意义.本实验室前期从粪产碱菌中获得可降解OTA的酰胺水解酶Af-OTd,本研究通过基因重组实现Af-OTd蛋白的高效表达,并对纯化的Af-OTd蛋白进行酶学性质分析.结果表明:纯化的A...     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

根据NCBI(GenBank Accession No.:D83732.1)中注册的米曲霉内切葡聚糖酶CelB基因序列设计引物,以本实验室自行筛选的天然米曲霉基因组DNA为模板,PCR高保真扩增出内切葡聚糖酶基因eg,将其定向插入到酵母表达载体pPICZαA上,转化酵母宿主菌X33,刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量约为65 ku。对酵母表达工程菌X33-eg进行发酵条件优化,结果显示最适甲醇诱导浓度为0.75%,用1 L三角瓶诱导培养5天达到最高酶活120 U/mL。对重组酶的酶学性质分析表明,其最适反应pH值和温度分别为pH4.0和45℃,在30～45℃和pH3.4～pH6.9范围内可保持内切葡聚糖酶最高酶活力70%以上。     

重组醇醛脱氢酶的分离纯化及性质研究

基因工程菌Y517#能表达醇醛脱氢酶,将L-山梨糖转化为VC的前体2-酮基-古龙酸(2-KGA)。通过超声波破碎菌体、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose FastFlow阴离子交换层析,Q Sepharose High Performance柱层析等过程,从Y517#发酵液中分离纯化了重组醇醛脱氢酶,纯化倍数为11倍。研究发现,该酶分子量为66kD,最适作用温度为40℃,对热不稳定,在60℃下保温10min酶活力完全丧失。最适pH值为7.0,pH稳定范围为6.0～9.0。     

豆豉溶栓酶工程菌的发酵条件及重组溶栓酶的分离纯化

对豆豉溶栓酶工程菌株WB DFE5进行了摇瓶发酵条件的研究 ,确定了发酵的优化条件为 :可溶性淀粉 2 % ,酪蛋白 2 % ,大豆蛋白胨 0 5 % ,酵母粉 0 15 % ,K2 HPO40 2 5 % ,KH2 PO40 0 5 % ,CaCl2 0 0 2 % ,MgSO40 0 5 % ,pH7 0。通过硫酸铵分段盐析、离子交换和凝胶过滤 ,从 1L工程菌株WB DFE5的发酵液中分离纯化出 12 5mg重组豆豉溶栓酶 ,酶的比活为 5 918 7IU/mg。     

Characterization and Cheese-Making Properties of Rennet-Like Enzyme Produced by a Local Algerian Isolate of Aspergillus niger

An ochratoxin free extracellular acid protease was produced by solid state cultivation of Aspergillus niger FFB1. The purified enzyme (48.7 kDa) showed an optimal milk clotting activity at pH 5.5 and 45°C in the presence of 0.01 M CaCl₂. The enzyme was stable at least 24 h at 35°C in the pH range of 5.5–7.0. Thermal denaturation started above 45°C. Fresh cheese manufactured with reconstituted cow milk and the purified enzyme showed similar basic characteristics (pH 4.5, acid taste, white color) as marketed cheeses obtained with calf rennet. This emphasizes the value of exploiting local biological resources for value added food processing in developing countries.     

猪肉12-脂肪氧合酶催化结构域的表达、纯化及其酶学性质分析

研究脂肪氧合酶（lipoxygenase,LOX）在猪肉贮藏、加工过程中对脂肪氧化及风味形成的作用机制。通过序列分析和聚合酶链式反应扩增获得了猪肉12-脂肪氧合酶催化结构域（12-lipoxygenase catalytic domain,12-LOXcd）的编码基因,采用大肠杆菌表达系统,经镍柱亲和层析和Superdex G200凝胶过滤层析纯化得到12-LOXcd蛋白,并研究其酶学性质。结果表明,构建的原核表达载体pMBP-12-LOXcd在大肠杆菌中成功可溶性表达了猪肉12-LOXcd,该重组蛋白经纯化可达电泳纯。12-LOXcd以亚油酸为底物的比活力为2 826.7 U/mg,最适pH值为6.0,最适作用温度为30 ℃。亚油酸Km为0.40 mmol/L,亚麻酸Km为0.55 mmol/L,花生四烯酸Km为4.15 mmol/L,表明最适底物为亚油酸。与大豆LOX相比,该酶在较高NaCl质量分数（9%）时仍保持活性稳定;对热较不稳定,在60 ℃条件下失活,但优于大豆LOX的热稳定性;此外,12-LOXcd的pH值稳定性也优于大豆LOX,在碱性条件下仍能保留部分活力。