蓝圆鲹骨骼肌脯氨酸内肽酶的分离纯化及其对胶原肽的作用

以蓝圆鲹为研究对象,探讨脯氨酸内肽酶(Prolyl endopeptidase,PEP)对鱼类肌肉胶原蛋白的作用及其机理。通过硫酸铵分级盐析,DEAE-Sephacel阴离子交换,Phenyl-Sepharose疏水层析和Q-Sepharose阴离子交换,从蓝圆鲹骨骼肌中分离纯化得到一种脯氨酸内肽酶。SDS-PAGE结果显示,PEP的分子量为82 ku,肽质量指纹图谱分析得到16个肽片段,共169个氨基酸残基。片段序列与墨西哥鲷鱼(Neolamprologus brichardi)PEP的同源性达98.8%,证明纯化得到的酶是PEP。PEP的最适温度为35℃,但热稳定性较差;最适p H为6.0,在p H 5.0~7.5之间有较好的稳定性。将PEP与合成的鱼胶原蛋白小肽反应,利用反相高效液相色谱对产物进行分离,电喷雾质谱分析结果显示PEP的水解位点在脯氨酸残基的羧基端。以上结果表明,鱼类肌肉中的PEP能够协同金属蛋白酶,通过切割脯氨酸残基进一步降解胶原小肽从而参与到鱼肌肉胶原蛋白的新陈代谢中,是鱼死后参与胶原蛋白降解的重要酶类。     

蓝圆鲹肝脏酯酶的分离纯化与性质分析

以蓝圆鲹肝脏为对象,通过硫酸铵盐析、Q-Sepharose阴离子交换柱层析、Q-HP阴离子交换柱层析、Phenyl Fast Flow疏水柱层析和Superdex G75凝胶过滤柱层析技术分离纯化得到一种酯酶.该酶的回收率为0.69％,纯化倍数为1150倍.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳与Superdex G75凝...     

蓝圆鲹肌肉组织蛋白酶B的纯化与性质分析

在鱼糜制品生产过程中,凝胶劣化现象是引起鱼糜品质下降的重要原因。研究表明,溶酶体中的内源性组织蛋白酶B会促进肌原纤维蛋白的降解,进而导致鱼糜凝胶劣化。迄今为止,多种鱼体肌肉中的组织蛋白酶B已有研究,但海水经济低值鱼蓝圆鲹中该酶的情况却尚未报道。本研究采用硫酸铵沉淀和柱层析相结合的方法,从蓝圆鲹肌肉中分离纯化得到分子量约为27ku的组织蛋白酶B。酶学性质结果显示,该酶最适温度和最适pH分别为55℃和5.5,半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64能有效抑制其活性。对肌原纤维蛋白的降解实验表明,在最适条件下,蓝圆鲹组织蛋白酶B对肌原纤维蛋白有一定的降解作用。因此,组织蛋白酶B参与肌原纤维蛋白的降解,更可能参与在低pH条件下鱼糜凝胶劣化。      

蓝圆鲹鱼油微胶囊的制备工艺优化及其稳定性

以蓝圆鲹鱼油为原料,通过单因素及响应面优化实验,研究喷雾干燥法制备蓝圆鲹鱼油微胶囊的工艺条件,考察鱼油含量、固形物含量、进(出)风温度及进料速度四个因素对鱼油微胶囊化效率的影响,并测定微胶囊的微观结构及稳定性。结果表明,喷雾干燥法制备蓝圆鲹鱼油微胶囊的最佳工艺条件为鱼油含量30%,固形物含量37%,进(出)风温度为190℃(85℃),进料速度为480 mL/h。在此条件下微胶囊包埋率为91.56%;所制得的鱼油微胶囊外观为圆球形颗粒,表面光滑、致密、无裂痕,整个表面性状良好;经60℃加速氧化6 d后蓝圆鲹鱼油微胶囊的过氧化值(peroxide value,POV)显著低于未微胶囊化鱼油(p<0.05),蓝圆鲹鱼油的稳定性在微胶囊化后得到显著提高(p<0.05)。      

蓝圆鲹肌肉中丝氨酸蛋白酶的分离纯化及性质研究

鱼类死后肌肉容易发生软化现象。研究表明,这与肌肉中的丝氨酸蛋白酶有着密切的关系。本研究通过硫酸铵盐析、DEAE-Sephacel、Q-Sepharose及Capto Q等柱层析相结合的方法,从蓝圆鲹肌肉中纯化得到一种具有分解明胶能力的丝氨酸蛋白酶,SDS-PAGE结果显示其分子量约为60ku,该酶最适温度及最适pH分别为40℃和9.0。丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc SC、Benzamidine、MBTI、PMSF和LBTI均能明显的抑制该酶的活性,而其他蛋白酶抑制剂对其活性没有明显的影响。底物特异性表明其能有效的降解丝氨酸蛋白酶荧光底物Boc-Leu-Lys-Arg-MCA,但进一步研究发现,该酶对I型胶原蛋白及明胶有明显的分解能力,同时对肌球蛋白重链也有一定的分解作用,说明该酶可能参与鱼肉保鲜中肌肉软化的过程。     

蓝圆鲹鱼油微胶囊的结构表征与体外消化特性

蓝圆鲹鱼油不饱和脂肪酸含量丰富,但极易被氧化而失去营养价值,目前微胶囊化包埋已成为防止鱼油氧化的稳态化技术之一。本研究采用扫描电子显微镜、激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope,LSCM）、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）及其二阶导数拟合和pH-stat法对喷雾干燥法制备的以阿拉伯树胶、明胶和海藻糖为壁材的蓝圆鲹鱼油微胶囊的形态结构、结构形成过程中的相互作用与体外模拟消化特性进行评价。结果表明：蓝圆鲹鱼油微胶囊颗粒圆整,表面光滑、致密;LSCM观察发现蓝圆鲹鱼油微胶囊呈现单核的腔体结构,壁材中明胶蛋白均匀分布在微胶囊的囊壁上,而鱼油被包裹在囊壁中。FTIR分析显示,壁材及芯材的特征吸收峰均出现在蓝圆鲹鱼油微胶囊的FTIR图谱中,证实了包埋结构的形成。经喷雾干燥后,蓝圆鲹鱼油微胶囊壁材中明胶蛋白质的二级结构中α-螺旋含量减少,说明蛋白分子间发生氢键缔合反应,增强了微胶囊结构的稳定性。体外模拟消化实验表明,鱼油微胶囊在消化过程中其游离脂肪酸释放率由快变慢,120 min时累积释放量为72.62%;LSCM观察发现,在消化过程中,鱼油微胶囊的芯材呈现出由中心向壁材表面迁移扩散并逐步释放的特征。本研究为微胶囊产品开发、应用评价体系的构建及其应用提供理论参考。     

蓝圆鲹传统腌干过程中内源脂肪酶和脂质降解氧化的变化分析

为探明传统腌干鱼类加工过程脂肪降解氧化规律,本研究以蓝圆鲹为原料,采用传统腌干方法,测定传统腌干鱼加工过程(鲜鱼、腌制、浸泡脱盐、烘干、成品)5个加工阶段的内源性中性脂肪酶(neutral lipase,NL)、酸性脂肪酶(acid lipase,AL)、磷脂酶(phospholipase,PL)、脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)活力变化,过氧化值(peroxide value,POV)、硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid value,TBARS)、脂肪酸含量变化,分析内源性脂肪酶与脂质降解、氧化的关系。结果表明:蓝圆鲹腌干过程中内源性脂肪水解酶活力均随着加工进程出现不同速率的降低情况,成品中NL、AL、PL活力保存率分别为:17%、57%、33%,LOX在腌干过程中活力显著增强(P0.05)。POV和TBARS均在加工过程中逐步上升,其中POV在烘干后期急速下降。主成分分析显示内源性脂肪水解酶对脂质的降解有一定的影响作用,对脂肪氧化的影响极小;LOX对脂肪降解的影响较小,与脂质的氧化正相关;多不饱和脂肪酸含量在腌制阶段和烘干阶段呈明显下降趋势(P0.05);单不饱和脂肪酸脂肪酸和饱和脂肪酸含量均在腌制阶段和烘干阶段显著增加(P0.05);二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸两者的含量变化呈现出互补状态。     

蓝圆鲹抗氧化肽与其他抗氧化剂的协同效应的研究

以DPPH·和O₂^-·清除率为指标,探讨了蓝圆鲹多肽（RSH-III）分别与其他肽类抗氧化剂GSH和非肽类抗氧化剂vitamin C的协同抗氧化效应。研究结果表明,当清除DPPH自由基时,低浓度条件下的RSH-III(0.2、0.4 g·L^-1)分别与GSH(1.0×10-3、2.0×10-3g·L^-1)和vitamin C(0.7×10-3g·L^-1)复合时未表现出协同效应;较高浓度(0.8 g·L^-1)时表现出负协同作用。当清除O₂^-·自由基时,RSH-III与低浓度GSH(1.3×10-3g·L^-1)复合时未表现出协同效应,较高浓度(2.5×10-3⁴.2×10-3g·L^-1)时表现出负协同作用;而与vitamin C复合清除O₂^-·自由基的清除率与抗氧化剂的添加浓度无关,均表现出负协同效应。该研究为蓝圆鲹抗氧化活性肽的应用奠定了较好的基础,可用于指导抗氧化活性肽的高效应用。      

蓝圆鲹在腌制过程中N-二甲基亚硝胺和N-二乙基亚硝胺的变化规律

研究蓝圆鲹在不同腌制条件下N-二甲基亚硝胺(NDMA)和N-二乙基亚硝胺(NDEA)的变化规律。以蓝圆鲹在腌制过程中产生的NDMA和NDEA为指标,分别考察粗盐和精盐、温度、盐度、干腌和湿腌法对NDMA和NDEA含量变化的影响。结果表明:(1)相同盐度下,粗盐腌制的样品中NDMA和NDEA含量较精盐腌制高;(2)盐度相同时,温度越高,NDMA和NDEA的含量也越高;(3)温度相同时,样品中的NDMA和NDEA含量以盐和鱼质量比1∶5组最高,盐和鱼质量比1∶8组次之,盐和鱼质量比1∶3组最低;(4)采用干腌法腌制时,当腌制时间大于10 d时,所有试验组中NDMA和NDEA含量的峰值均消失;(5)湿腌法比干腌法样品中NDMA和NDEA含量高。因此,为减少腌制产品中NDMA和NDEA的积累,建议采用精盐低温高盐的干腌法进行腌制,并在腌制时间超过10 d NDMA和NDEA含量的峰值降低后进行食用。     

基于虚拟筛选的酸性磷酸酶抑制剂及其抑制机理

磷酸酶是参与水产品鲜味物质肌苷酸(IMP)的降解途径中的关键酶,以海鲈鱼肝中酸性磷酸酶为研究对象,通过同源建模、分子对接等手段,从中药化合物中虚拟筛选出ACP抑制剂,并研究其抑制机理。结果表明:苯甲酸、槲皮素、十六烷二酸、二氢白藜芦醇具有很强的抑制磷酸酶活性作用。选取抑制效果最好的十六烷二酸结合荧光光谱分析,结果表明:氢键和范德华力是十六烷二酸与ACP结合的主要驱动力,同时导致ACP荧光强度降低,最大发射波长红移。十六烷二酸与ACP的活性中心结合,使ACP二维和三维结构发生变化,降低了ACP与IMP的接触,可延缓IMP降解。     

重组鲍鱼肌肉脯氨酰内肽酶的性质研究

为研究皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）中脯氨酰内肽酶（Prolyl endopeptidase,Hdh-PEP)的酶学特性与结构特性,利用基因工程技术重组并在大肠杆菌中高效表达了皱纹盘鲍PEP。原核表达的Hdh-PEP分子量为85 kDa,在pH2～6、温度20～60 ℃条件下,Hdh-PEP的表面疏水性明显升高。氨基酸序列同源性分析结果表明,Hdh-PEP催化结构域中有三个高度保守的氨基酸序列:Seq 1:K-D-G-T-K/R-I-P、Seq 2:Y-G-Y-G-G-F和Seq 3:I-R-G-G-E-Y/F。酶动力学研究表明,Hdh-PEP的米氏常数K_m为5.32 μmol/L,催化常数k_cat值为15.7 s?1。PEP的特异性抑制剂SUAM-14746和ZPP对Hdh-PEP酶活力具有强抑制作用,丝氨酸蛋白酶抑制（PMSF）对Hdh-PEP酶活力也有较大程度的抑制作用。本实验制备了高特异性抗Hdh-PEP多克隆抗体,可检测鲍鱼肌肉中天然PEP的存在情况。Hdh-PEP的体外高效表达和特异性多克隆抗体制备为后续深入研究Hdh-PEP的性质提供了重要参考。     

鲈鱼脯氨酰内肽酶的分离纯化、性质分析及分子克隆

采用(NH4)2SO4盐析和连续柱层析法从鲈鱼（Lateolabrax japonicus）骨骼肌中分离纯化了一种脯氨酰内肽酶（prolyl endopeptidase,PEP）。通过液相色谱-串联质谱分析,得到43 个与红鳍东方鲀的PEP高度一致的肽片段,证实该酶为PEP。以琥珀酰-甘氨酰-脯氨酸-4-甲基-7-香豆素为底物,确定PEP的最适pH 6.0和最适温度35 ℃。温度变化对PEP活力的影响较大,通过圆二色谱检测显示加热对PEP的二级结构有较为明显的影响,且热变性不可逆。通过分子克隆技术获得PEP全长cDNA开放阅读框含2 226 个核苷酸,编码741 个氨基酸残基,预测分子质量为84.12 kDa。通过同源建模得到鲈鱼PEP的分子结构,PEP为典型的α/β水解酶折叠排列,其催化三联体（His-711、Asp-672、Ser-585）被β-折叠形成的螺旋桨区域的中心通道所覆盖。催化活性中心空间构象稳定对维持PEP活力至关重要,而其独特的分子结构是底物特异性的基础。     

碱性蛋白酶限制性酶解对蓝圆鲹分离蛋白功能特性的影响

以蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)分离蛋白为原料,采用碱性蛋白酶对其进行限制性酶解,研究水解度(degree of hydrolysis,DH)对分离蛋白酶解产物溶解性、持油力、乳化性与起泡性等功能特性的影响.结果表明,碱性蛋白酶酶解产物的相对分子质量显著下降.酶解可有效提高分离蛋白的溶解性,其溶解度随...     

蓝圆鲹酸/碱等电点沉淀法分离蛋白凝胶特性与消化特性

采用酸/碱等电点沉淀（isoelectric solubilization/precipitation,ISP）法制备蓝圆鲹肌肉分离蛋白（acid/alkaline aided protein isolate,API/KPI）,并对全蛋白（total protein,TP）、肌原纤维蛋白（myofibrillar protein,MP）与分离蛋白的理化特性、凝胶特性以及消化稳定性进行比较研究。结果表明,蓝圆鲹肌肉蛋白在碱性条件下溶解性显著高于酸性条件,经优化后的API与KPI的回收率分别为65.0%与84.6%,显著高于MP（54.0%）。KPI、API与MP的脂肪与灰分含量明显低于TP,其中KPI的粗蛋白含量最高。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示KPI与API的蛋白组成与TP相近,但KPI与API的氨基酸组成中甘氨酸与脯氨酸含量显著低于TP。质构与流变学分析结果显示,KPI与API的凝胶强度与储能模量（G’）均明显低于TP与MP,其中TP、MP与KPI的储能模量在50～55 ℃会出现明显的下降趋势,表明发生凝胶劣化现象,而API组无明显变化。扫描电子显微镜结果表明,与90 ℃相比,经55 ℃加热处理的KPI、TP与MP组凝胶结构更加疏松、多孔,这与流变学分析的结果一致。体外模拟胃肠液消化实验表明,MP具有最佳的消化性,API与KPI的消化性相当,且显著高于TP。综上所述,利用ISP制备分离蛋白可显著提高蛋白回收率,且分离蛋白的消化性明显优于TP。由于分离蛋白失去凝胶化能力,故可考虑将其应用于食品蛋白配料领域。     

绿豆中胰蛋白酶抑制子的纯化及部分性质的研究

本文研究将绿豆经过粉碎、过筛和正己烷脱脂后,采用（NH4）2SO4分级沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换、Sephacryl S-200凝胶过滤等方法,对其中的胰蛋白酶抑制因子进行了分离纯化。然后研究了所纯化出的胰蛋白酶抑制子的pH和温度稳定性,实验结果表明：在20～100℃的范围和pH 2.2～10.2范围内,胰蛋白酶抑制因子性质较稳定。