单增李斯特菌(EGDe)sigB基因缺失株的构建及其生物特性的初步鉴定

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种人畜共患的食源性致病菌,在感染过程中可以穿越人体肠道屏障、胎盘屏障及血脑屏障,进而引发肠胃炎、脑膜炎及孕妇流产等疾病。Sigma B(sigB)基因编码产生的sigma B因子是许多革兰氏阳性菌对环境胁迫产生应答反应的主要调控因子,并且直接或间接的调控Lm中相关重要毒力基因如prf A、inl A等的表达。本文通过同源重组技术将Lm野生菌株EGDe的sigB基因敲除,并且对缺失菌株的生长曲线,inl A、inl B、prf A等13种Lm的毒力基因表达水平及对肠道上皮细胞Caco-2的侵袭进行了研究。实验表明,EGDe-ΔsigB基因缺失菌株生长速度与EGDe基本一致;sigB基因的缺失造成inl A和inl B基因表达水平的大幅度下调,但act A和plc A等毒力基因却上调4~5倍,说明sigB基因对于单核增生性李斯特菌的一些毒力基因表达影响比较大;Caco-2细胞的侵袭实验显示EGDe-ΔsigB基因的缺失对Caco-2细胞侵袭能力的下降。     

单增李斯特菌prfA基因缺失菌株的构建及其生物学特性鉴定

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种风险较高的食源性致病菌,其绝大多数毒力基因的表达均受到由prfA基因编码的PrfA(positive regulatory factorA)蛋白全部或部分调控。使用同源重组的方法敲除Lm野生菌株EGDe的prfA基因,并通过测定生长曲线、毒力基因表达和侵袭Caco-2细胞能力等探讨单缺失菌株EGDe-ΔprfA生物学特性。通过测定生长曲线显示prfA敲除株和野生型EGDe二者生长状态无差异;运用实时定量荧光聚合酶链式反应检测EGDe-ΔprfA的主要毒力基因表达,结果显示plcA、plcB毒力基因的表达量分别上升至原来的2.5倍和2倍,inlA、inlB、inlC、actA、vip等均呈下降趋势,prfA基因表达量趋向于零;侵袭Caco-2细胞结果显示EGDe-ΔprfA侵袭数为野生株的1/5。该基因缺失菌株的构建及生物学特性研究对食源性致病菌EGDe致病机理研究具有重要意义并且提供了重要材料。     

CodY在单核细胞增生李斯特菌抗氧化胁迫中的作用

目的：探究全局性转录调控因子CodY在单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）抗氧化应激中的作用。方法：利用H2O2对处于对数中期（OD600 nm=0.65）的Lm野生株EGDe和CodY缺失株EGDeDcodY进行氧化胁迫，比较两菌株氧化耐受能力、抗氧化应激物（过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH））活性或含量差异；通过随机扩增多态性DNA技术比较两菌株基因组模板稳定性（genomic template stability，GTS）；利用实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）检测两菌株抗氧化应激物编码基因以及DNA损伤诱导反应（SOS反应）重要基因的转录表达变化。结果：1）H2O2对EGDe的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度大约是EGDeDcodY的2 倍，当H2O2浓度超过20 mmol/L时，EGDeDcodY抑菌圈直径极显著大于EGDe（P≤0.01）。2）200 mmol/L H2O2完全抑制EGDeDcodY生长而EGDe生长速率则有所减慢。3）H2O2胁迫使EGDe和EGDeDcodY中CAT活力均下降，但转录水平并没有显著变化；SOD活力在两菌株内无明显变化，但转录表达在EGDe和EGDeDcodY中差异高度显著（P≤0.001）；值得注意的是，GSH编码基因的转录表达和其含量在EGDe和EGDeDcodY中变化趋势基本一致，随H2O2胁迫时间延长呈先显著下降后略微上升，而且与EGDe相比，GSH在EGDeDcodY中的转录表达水平具有极显著差异（P≤0.01）。4）EGDe和EGDeDcodY的GTS分别为93.1%和80.0%；real-time PCR显示EGDeDcodY中参与SOS反应的重要基因（recA、lexA、recR、lmo1302、lmo1975）转录表达受到高度显著抑制（P≤0.001），而EGDe中recA、lmo1302和lmo1975的转录表达被激活。结论：CodY缺失导致细菌在H2O2胁迫下的耐受能力和生长速率显著降低，GSH含量下降，GTS降低，参与SOS反应的重要基因表达受到显著抑制，表明CodY在Lm抵御氧化胁迫中发挥了重要的调控作用。     

假单胞菌的聚-β-羟基丁酸酯聚合酶基因的克隆与表达

根据Gen Bank上公布的假单胞菌属的phb C基因设计引物。以假单胞菌UVCN18基因组DNA为模板,成功克隆了菌株假单胞菌UVCN18中的PHB聚合酶基因phb C。生物信息学方法分析表明,该基因全长1 704 bp,编码567个氨基酸。通过Blast P序列对比发现,该基因所表达的氨基酸属于PHA聚合酶家族。将获得的基因序列提交到Gen Bank,得到登录号为KT716020。采用MEGA5.1软件构建系统发育树,显示该基因编码的氨基酸序列与菌种恶臭假单胞菌所表达的氨基酸序列的同源性较高。同时构建工程菌大肠杆菌BL21-p ET-28a(+)-phb C,经IPTG诱导过量表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定结果与PHB聚合酶分子质量63 ku理论相符合,证明实现了异源蛋白表达。     

食源性单增李斯特氏菌Lm319的毒力基因在四种肉汤培养基中表达分析

为了探明食源性单增李斯特菌的毒力基因在四种不同天然肉汤中的表达情况,了解食源性单增李斯特菌在不同肉类食品中的毒力水平。对单增李斯特菌Lm319中27个毒力基因进行PCR检测,并对Lm319在猪、鸡、牛和羊四种肉汤培养条件下27个毒力基因的表达情况进行RT-PCR检测。结果显示:单增李斯特菌Lm319中含有23个毒力基因;猪肉汤培养基中能表达的毒力基因种类以及基因表达量都是最高的,其次是羊肉肉汤培养基和牛肉肉汤培养基,而鸡肉肉汤培养基中表达的基因最少;同时发现iap、fbp、hpt和bsh这4个毒力基因的表达与prf A基因存在相关性。本研究表明,单增李斯特菌在不同生长环境下其毒力基因表达存在较大差异。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌调查及毒力研究

为了解和掌握各类食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Lm)污染状况及菌株的毒力情况,采集5类265件食品,菌株鉴定应用API细胞鉴定系统;毒力测定采用溶血实验、多聚酶链反应（PCR）以及小鼠致病力实验的方法进行,结果显示Lm检出率为4.90%;其中从生肉、熟肉、灌汤和速冻食品中的检出率分别为15.00%、2.48%、9.52%;从熟肉和速冻食品中还检出其它李斯特氏菌,检出率分别为4.96%、5.92%;乳制品和水产品中未检出Lm。13株Lm毒力测定显示,溶血实验与小鼠的致病力和PCR测定的溶血素基因无必然联系,而溶血素基因与内化素基因阳性结果相同,Lm对多种抗生素敏感,其中对氨氨苄青霉素、头孢唑啉和环丙沙星敏感率为100%。     

唾液乳杆菌M18-6体外抗氧化功能评价及其机制探讨

分别检测了唾液乳杆菌M18-6菌悬液、无细胞上清液及细胞内容物的体外抗氧化功能指标,包括DP-PH自由基清除率、抑制亚油酸过氧化率、羟自由基(·OH)清除率、抗氧化相关酶活力等,并结合菌株基因组信息,利用实时荧光定量PCR,检测菌株中11个抗氧化功能相关的基因在mRNA上的表达水平,以期对菌株体外抗氧化功能进行全面评价,并从分子水平进一步探讨其抗氧化的机理。结果显示,唾液乳杆菌M18-6无细胞上清液清除DPPH自由基和·OH的清除能力、抑制亚油酸过氧化率的能力均显著高于鼠李糖乳酸杆菌LGG(P<0.05),在菌株无细胞上清液中检测到较强的谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性,表明唾液乳杆菌M18-6无细胞上清液中有较强的抗氧化能力。在2.5 mmol/L H_2O_2胁迫下,菌株的NADH氧化酶和超氧化物歧化酶编码基因在mRNA上表达水平分别上调了6.2和4.5倍,硫氧还蛋白系列的基因(trx A1、trx A2、trx A3、trx)和过氧化氢酶基因表达水平也均上调2倍以上,推测唾液乳杆菌M18-6可能通过上调NADH氧化酶基因与硫氧还蛋白系统相关基因表达,激活硫氧还蛋白系统,通过上调sod和cat基因表达水平,提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的酶活力,发挥抗氧化作用。     

单核细胞性李斯特菌基因dal的敲除及其生物学特性初步分析

在单核细胞性李斯特菌(Listeria monocytogenes)野生株EGDe act A及inl B双基因缺失株(EGDeΔact AΔinl B)的基础上,利用同源重组的方法进一步构建了缺失营养基因dal的菌株(EGDe Δact AΔinl BΔdal),并对该缺失菌株生长状态、毒力基因表达水平、生物被膜的形成量及细胞侵袭等方面作进一步分析。结果显示,37℃摇床培养6 h后,缺失株的菌浓度显著低于EGDe Δact AΔinl B(P0.001),培养基中补充D-丙氨酸的缺失株生长速率与亲本株相比无显著差异;实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示,缺失株的sig B基因表达水平变化最明显(P0.01),约下调90%;缺失株生物被膜形成量显著增加(P0.05),培养基补充D-丙氨酸后缺失株生物被膜的生成量与亲本株相比无差异;对Coca-2细胞的侵袭无影响,表明该基因对细菌生长能力及生物被膜形成具有重要的调控作用,并不影响菌株对细胞的侵袭力。此缺失株的构建为进一步研究基因dal的功能提供了理论支持。     

染料木黄酮对β淀粉样肽介导的脑血管内皮细胞损伤的保护作用研究

目的研究染料木黄酮(Gen)对β淀粉样肽25-35(Aβ25-35)介导的脑血管内皮细胞损伤的调节作用。方法脑血管内皮细胞(b End.3细胞系)传代48 h后,分为4组(对照组、Aβ组、Gen组、Gen+Aβ组)。Gen预处理2 h后,Aβ25-35染毒建立细胞损伤模型;24 h后收集细胞进行指标检测。采用ELISA法检测脑血管内皮细胞8-OHd G水平;酶法试剂盒检测GSH-Px水平;RT-PCR和Western blot法检测Bcl-2、Bax基因和蛋白表达的改变。结果与对照组比较,Aβ组8-OHd G水平明显升高,GSH-Px活性明显下降,且差异均有统计学意义(P0.05);与Aβ组比较,Gen组和Gen+Aβ组8-OHd G水平明显下降,GSH-Px活性明显升高,且差异均有统计学意义(P0.05);同时,Aβ组Bcl-2基因和蛋白表达水平较对照组明显下调,Bax基因和蛋白表达水平明显上调,且差异均有统计学意义(P0.05);与Aβ组比较,Gen+Aβ组和Gen组Bcl-2基因和蛋白表达水平明显上调,Bax基因和蛋白表达水平明显下调,且差异均有统计学意义(P0.05)。结论 Gen可能通过拮抗Aβ25-35介导的脑血管内皮细胞氧化损伤,进而发挥对脑血管的保护作用。     

双基因敲除减毒单增李斯特菌(ΔactA/ΔinlB)的构建及其生物学初步鉴定

减毒单增李斯特菌具有成为疫苗活载体的潜力,可同时引起MHCⅠ和MHCⅡ类抗原递呈系统,具有强烈激发CD8+和CD4+细胞免疫的能力。构建毒力基因缺失菌株进而评估其生物活性对于其作为疫苗活载体的开发尤为重要。本文采用同源重组技术构建单缺失菌株Lm-△act A和双缺失菌株Lm-△act A△/inl B,从生长状态、毒力基因表达和对Hep G2细胞侵袭能力方面探讨减毒菌株生物学特性。生长活性测定显示两种减毒菌株和野生型Lm(EGD-e)三者生长状况无差异;实时定量PCR结果显示act A基因缺失后,inl A基因表达水平上升两倍;act A和inl B基因双缺失后,plc B和hly基因的表达水平都有较大幅度的上升;侵袭Hep G2细胞结果显示act A基因缺失后侵袭能力增强、act A和inl B基因共同缺失后侵袭能力减弱。因此,减毒菌株的构建及其生物特性研究不仅对食源性致病菌Lm致病机理具有重要意义,也为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础。     

inlA和inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌侵袭HT29结肠癌细胞的影响

单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）是人畜共患的食源性致病菌,其可以穿透多个宿主屏障,而内化素蛋白家族被认为是LM穿透宿主屏障过程中起重要作用的毒力因子。本研究利用同源重组的方法构建了LM野生菌株EGDe的inlA和inlB基因双缺失菌株,利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测其主要毒力基因表达的变化,并以HT29结肠癌细胞为对象,研究inlA和inlB基因缺失对LM侵袭宿主细胞能力的影响。结果表明基因的缺失对其生长能力没有影响,但多个毒力基因的表达发生了不同程度的变化,同时发现inlA和inlB基因的缺失使LM侵袭HT29结肠癌细胞的能力显著下降（P＜0.05）。本研究成功构建LM的inlA和inlB基因双缺失菌株,并初步研究了基因缺失对LM侵袭宿主细胞能力的影响,为深入研究内化素InlA和InlB在LM入侵宿主细胞过程中的具体作用提供了支持。     

鲜活贝类中单核细胞增生李斯特菌的分离鉴定及毒力基因与耐药性分析

目的研究采自产地的鲜活贝类中单核细胞增生李斯特菌(单增李斯特菌)的污染状况、毒力基因分布与耐药性。方法对采自产地的200份鲜活贝类,按照GB/T 4789.30—2010《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行单增李斯特菌的分离与鉴定;采用Kirby-Bauer纸片扩散法测定分离株的耐药性;通过PCR法分析分离株9个毒力基因(包括prfA、plcB、hly、actA、iap、inlA、plcA、mpl、inlB)。结果在200份鲜活贝类中,共检出阳性样品4份(2.0%);有1株缺失inlB基因,1株缺失mpl基因;分离株对氨苄青霉素、庆大霉素等一线临床治疗药物敏感,但有2株对四环素和复方新诺明同时耐药,1株对复方新诺明和氧氟沙星耐药。结论采自产地的鲜活贝类存在单增李斯特菌的污染,分离株毒力基因有一定程度缺失,提示初级水产品中的单增李斯特菌污染需引起关注,并且需要继续加强食品中该菌的耐药性监测。     

Maillard reaction causes suppression of virulence gene expression in Listeria monocytogenes

Many environmental signals affect the expression of virulence genes of the food borne pathogen Listeria monocytogenes. In addition media composition has been shown to suppress levels of haemolytic activity. Using a Pr(plcA)::luxAB reporter gene fusion it was observed that the heat processing of media also reduces the level of virulence gene expression in L. monocytogenes without affecting its growth. Physicochemical factors that are considered to enhance the Maillard reaction were also found to increase the levels of suppression. The results indicate that heat treatment of a multicomponent matrix gives rise to specific inhibitors of the Listeria virulence gene operon.     

单核细胞增生李斯特菌菌株分型与其致病潜力基因相关性研究进展

单核细胞增生李斯特菌是一种常见的食源性致病菌,该菌分型繁多。不同分型的单核细胞增生李斯特菌致病潜力不同,这与菌株所携带的抗性基因和毒力基因不同有关。本文综述了不同分型单核细胞增生李斯特菌与抗性基因和毒力基因的关系,结果发现与该菌抗性相关的基因,如热抗性、耐冷性、酸抗性、耐高渗、耐干燥、耐金属和杀菌剂及参与应激蛋白表达调控的基因较多,它们与分型之间的关系暂无明确相关性结论,但也发现应激生存岛（stress survival island,SSI）-1仅存在于谱系I和谱系II部分菌株中,SSI-2目前仅被发现在ST121菌株中携带。从功能毒力基因和李斯特菌毒力基因岛（Listeria pathogenicity islands,LIPI）两方面分述了毒力基因,LIPI-3和LIPI-4主要存在于谱系I菌株中。此外,ST5、ST8、ST9和ST121菌株的inlA基因中出现提前终止密码子,使得菌株的毒力降低。研究不同分型单核细胞增生李斯特菌致病潜力基因的差异有助于单核细胞增生李斯特菌的预警预测、防控,并为不同分型菌株致病机制的深入研究提供参考。     

二烯丙基二硫醚对单增李斯特菌毒力基因表达的影响

二烯丙基二硫醚(DADS)是一种典型的硫醚类香料。该类香料在抗菌消炎,提高机体免疫力,预防和治疗心血管疾病等保健及药理作用方面具有显著效果。而对其在食源性致病菌中的抑制作用及相关机理研究较少。四大食源性致病菌之一单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)容易感染食物而引发脑膜炎、败血症及孕妇流产等一系列恶性疾病。本研究以如何高效抑制单增李斯特的生长为出发点,以DADS为研究对象,采用微量肉汤稀释法初步筛选出其对单增能李斯特菌的最小抑菌浓度(MIC),利用RT-qPCR技术考察其对单增李斯特菌毒力基因inlA、hlyA、prfA表达的影响。结果表明:亚抑菌浓度下DADS均可显著抑制毒力基因inlA、hlyA、prfA的表达,且抑制作用呈现一定的浓度依赖性,hlyA及prfA对其作用更敏感。     

单核增生性李斯特菌hly缺失菌株的构建及生物特性的初步鉴定

为研究单核增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)hly基因对毒力的影响,利用同源重组原理,使用穿梭载体,构建单核细胞增生性李斯特菌野生菌株EGD-e的hly基因缺失菌株EGD-eΔhly。细菌活性实验证明缺失菌株生长状态与亲本无差异,但EGD-eΔhly丧失溶血活性,细胞侵袭能力降低约90%,在10~7 cells/m L腹腔注射条件下不表现动物毒性。在转录水平上EGD-eΔhly的毒力基因inl C、prf A的表达量分别下降了81%和76%,act A、plc B的表达量分别提高了2.7倍和1.8倍。hly缺失菌株的成功构建及生物特性的初步研究结果为研究Lm致病机理提供依据。     

温州市单核细胞增生李斯特菌的毒力基因及血清学分型和分子分型研究

目的了解温州市近十年单核细胞增生李斯特菌分离株的血清型、毒力基因及分子分型特征。方法用聚合酶链式反应(PCR)方法对单核细胞增生李斯特菌进行血清型及毒力基因检测;用多位点序列分型(MLST)方法对单核细胞增生李斯特菌进行分子分型,并绘制MLST数据的最小生成树。结果 97株单核细胞增生李斯特菌分离株分为4种血清型,以血清型1/2b、1/2a为优势血清型,占比分别为48.45%(47/97)、35.05%(34/97);而毒力基因iap、prfA基因阳性率均为100.00%(97/97),hlyA、inlA基因阳性率均为97.94%(95/97),plcB基因阳性率为96.91%(94/97)。其中患者分离株5种毒力基因阳性率均为100.00%(6/6)。97株单核细胞增生李斯特菌分离株得到20个MLST型别,其中ST87型是优势型别,其次为ST121和ST9,ST1和ST779型是患者特有的,ST2、ST3、ST5型分布于食品和患者分离株。结论温州市不同来源的单核细胞增生李斯特菌分离株分子型别呈多态性,食品和患者分离株存在相同的ST型,且这些菌株大部分携带毒力基因,具有潜在的致病性,因此食品中单核细胞增生李斯特菌污染的潜在风险不容忽视。