改造非磷酸转移酶葡萄糖转运途径强化解淀粉芽胞杆菌合成L-酪氨酸

L-酪氨酸是一种重要的营养必需氨基酸,广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。非磷酸转移酶葡萄糖转运途径是细菌吸收转运葡萄糖的重要途径,对细菌的新陈代谢具有显著的影响。以解淀粉芽胞杆菌HZΔptsH为出发菌株,表达了不同物种来源的葡萄糖转运蛋白编码基因,探究非磷酸转移酶葡萄糖转运途径基因对解淀粉芽胞杆菌合成L-酪氨酸的影响。摇瓶发酵结果表明,HZΔptsH强化表达自身来源葡萄糖转运蛋白编码基因glcP后,L-酪氨酸产量提高了22%,而表达大肠杆菌的galP基因和谷氨酸棒状杆菌的idolT1基因对L-酪氨酸产量没有显著性的影响。研究证实,过表达解淀粉芽胞杆菌自身glcP基因是一种有效的L-酪氨酸强化策略,该研究为后续解淀粉芽胞杆菌合成L-酪氨酸的代谢工程育种提供了借鉴。     

敲除ptsG基因及共表达透明颤菌血红蛋白提高大肠杆菌SHMT产量

利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)的ptsG基因,得到ptsG基因缺失菌株BL21(DE3)ΔptsG。构建重组质粒,得到表达大肠杆菌丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)工程菌株BL21(DE3)/pET-glyA、BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA,及共表达SHMT和透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)工程菌株BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV。在LB培养基中,BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株与BL21(DE3)/pET-glyA菌株生长情况没有明显差异,BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV菌株稳定期的OD 600 nm值比BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株提高了21.3%,在LBG培养基中,稳定期BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株OD600 nm值比BL21(DE3)/pET-glyA菌株提高了19.4%,BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV菌株OD600 nm值比BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株提高了21.5%。在LBG培养基中,经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,与对照菌株BL21(DE3)/pET-28a相比较,两种单表达工程菌株产SHMT活力分别是其6.4倍和7.7倍,共表达工程菌株产SHMT活力是其9.6倍。实验结果表明,敲除ptsG基因能够增加大肠杆菌在含葡萄糖培养基中的生长量及SHMT表达量,共表达VHb能进一步提高菌株生长量和SHMT产量。     

产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌诱变后突变基因对生长和产酸的影响

在前期研究中,通过比较基因组学分析发现产L-丝氨酸野生型谷氨酸棒杆菌SYPS-062及其突变株SYPS-062-33a之间有12个基因突变。对其中5个差异基因进行回复突变或敲除的研究,发现丙酮酸脱氢酶亚基ace E点突变与突变株SYPS-062-33a副产物积累量直接相关。在此基础上其余7个突变基因对菌株产酸和生长的影响将进一步研究,在高产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌ΔSSAAI中分别敲除这7个基因,发现敲除基因SD36_RS01255后,菌株OD562下降25.8%,L-丝氨酸产量下降26.4%,仅积累19.25 g/L。通过比对NCBI蛋白数据库,对基因SD36_RS01255编码的蛋白进行功能预测分析,发现其编码的蛋白部分区域与质粒pRi A4b ORF-3编码的蛋白类似,参与DNA修复。敲除基因SD36_RS01255影响DNA的修复,从而造成菌株生长和L-丝氨酸产量的下降。而过表达基因SD36_RS01255对谷氨酸棒杆菌ΔSSAAI的生长、L-丝氨酸的产量却未造成显著影响。     

大肠杆菌ptsG基因缺陷菌株的构建及其发酵混合糖产L-丙氨酸

为了增强大肠杆菌（Escherichia coli）JH-B2利用混合糖产L-丙氨酸的能力,通过Red同源重组技术敲除了转运葡萄糖的关键基因ptsG,构建新菌株JH-B3。结果表明,以10%混合糖（5%葡萄糖和5%木糖）为碳源,ptsG基因缺陷菌株JH-B3同时利用葡萄糖和木糖,且在32 h时利用完葡萄糖,表明了ptsG基因的敲除大幅减弱了葡萄糖效应;而菌株JH-B2在发酵24 h时利用完葡萄糖,在28 h时才开始利用木糖,表现出葡萄糖效应。发酵至98 h,ptsG基因缺陷菌株JH-B3已经利用完木糖,其丙氨酸产量为94.1 g/L,生产强度为0.96 g/（L·h）,而菌株JH-B2在同等时间内还剩18.10 g/L木糖未利用,其丙氨酸产量为77.6 g/L,生产强度为0.79 g/（L·h）。ptsG基因缺陷菌株JH-B3的丙氨酸生产强度较JH-B2提高了21.5%,能够同时利用混合糖发酵产丙氨酸,为利用木质纤维素糖源生产丙氨酸提供了工业应用基础。     

高产L-精氨酸谷氨酸棒状杆菌的构建

以产L-精氨酸诱变菌株谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）AJC为出发菌株,采用基因组编辑技术对其进行改造。 首先,敲除阻遏蛋白ArgR和FarR,解除反馈阻遏作用;然后,敲除乳酸脱氢酶编码基因ldh和整合鸟氨酸乙酰转移酶编码基因argJ,阻 断乳酸合成途径和增加前体物;最后,敲除谷氨酸分泌蛋白编码基因NCgl1221和整合乙酰谷氨酸激酶基因argB,减弱L-谷氨酸的胞 外分泌,筛选一株L-精氨酸高产菌株。 结果表明,获得一株高产L-精氨酸菌株AJC-4（C. glutamicum AJCΔargRΔfarRΔldh::PtufargJ ΔNCgl1221::PsodargB）,该菌株在5 L发酵罐中发酵64 h后,L-精氨酸产量和糖酸转化率分别为78.0 g/L和0.38 g/g,较出发菌株AJC分 别提高21.9%、18.8%;副产物乳酸和L-谷氨酸积累量分别为0.11g/L、0.16 g/L,较出发菌株AJC分别降低96.8%、96.1%。     

磷酸转移酶系统关键基因敲除对Klebsiella pneumoniae产1,3-丙二醇的影响

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)在以葡萄糖作辅底物发酵甘油生产1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PDO)过程中,由于细胞存在碳分解代谢抑制现象,葡萄糖优先于甘油被菌体吸收代谢用于细胞生长及副产物的累积,影响1,3-PDO的合成。基于K.pneumoniae葡萄糖转运及碳代谢调控相关的磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS),利用Red重组技术对PTS系统中与葡萄糖特异性转运相关的基因ptsG(编码葡萄糖特异性转运膜透性酶EⅡBC~(Glc))、crr(编码胞浆可溶性葡萄糖特异性转运酶EⅡAGlc)分别进行敲除,并考察上述基因缺失对细胞生长、1,3-PDO合成和副产物代谢的影响。结果显示,敲除ptsG、crr基因后,甘油转化率较野生菌分别提高26.2%和42.7%,其中突变株K.pneumoniaeΔcrr的1,3-PDO的产量达到23.1 g/L,提高35.8%。上述结果表明,敲除ptsG、crr基因改造PTS系统能够有效提高底物甘油利用率,强化1,3-PDO合成。     

代谢工程改造Corynebacterium glutamicum生产L-苹果酸

以提高L-苹果酸的产量为目标,采用一次交换两次同源重组的方法,利用反向筛选标记,在敲除了丙酮酸醌氧化还原酶编码基因(pqo),丙酮酸脱氢酶编码基因(pdh)和乳酸脱氢酶编码基因(lldh)的C.glutamicumΔpqoΔpdhΔlldh(C.glutamicumΔPPL)基础上,无痕敲除了L-苹果酸积累支流代谢途径的2个关键酶基因:苹果酸醌氧化还原酶编码基因(mqo)和苹果酸酶编码基因(male),同时敲入了苹果酸分泌转运蛋白基因(transb),获得了产L-苹果酸的工程菌株;采用高效液相色谱法检测了工程菌株C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale的发酵产物。实验结果表明:C.glutamicum ATCC 13032发酵后不积累L-苹果酸,而工程菌C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale发酵48 h,积累了12.8 g/L的L-苹果酸,工程菌的糖酸转化率为33.18%,为利用C.glutamicum ATCC 13032发酵生产L-苹果酸提供了基础遗传资源。     

一种谷氨酸棒杆菌基因无痕敲除载体的构建及应用

以谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）23604编码赖氨酸胞内转运蛋白基因lysP为敲除对象,利用重叠PCR技术将 lysP基因的上下游同源臂融合,并构建了由木糖启动子Pxyl和毒素蛋白基因mazF组成的筛选盒,同时无缝克隆连接至带有卡那霉素抗性基因的pTOPO载体中,经电转化及两次同源单交换筛选,实现lysP基因的无痕敲除。 结果表明,经过卡那霉素抗性筛选、木糖二次筛选及基因组PCR鉴定后,成功获得lysP基因缺失菌株C.glutamicum23604ΔlysP;发酵后C.glutamicum23604ΔlysP赖氨酸产量较对照菌株产量提高了10.8%。该实验以大肠杆菌毒素蛋白基因mazF作为反向筛选标记的敲除载体,实现谷氨酸棒杆菌lysP的高效敲除; lysP基因的敲除使得赖氨酸不能进入胞内而在胞外积累,从而达到增产赖氨酸的目的。     

CRISPR/Cas9介导的果糖低消耗酿酒酵母工程菌的构建

利用酿酒酵母为宿主,以果糖为原料合成D-阿洛酮糖具有食品方面的先天优势。为了减少酿酒酵母宿主本身对果糖的消耗,对酿酒酵母的己糖激酶同工酶2(Hexokinaseisoenzyme2,hxk2)基因进行编辑。本研究采用CRISPR/Cas9技术,构建了Cas9和gRNA共表达质粒p YES2-CG-Δhxk2,以酿酒酵母BY4741为出发菌株,URA3为筛选标记,采用高效电击转化法和胞内同源重组技术,获得hxk2基因缺陷株BY4741-Δhxk2。在此基础上,进行果糖发酵实验以评估突变菌株的果糖消耗速率。实验结果显示,发酵培养14 h时,缺陷株BY4741-Δhxk2果糖消耗速率为3.35 mg/h;与野生型菌株相比其下降了6.42%。此外,发酵培养22 h,BY4741-Δhxk2的OD600nm值为8.65,相比于野生型提高了6.40%。研究表明,己糖激酶hxk2基因的缺陷编辑可以一定程度降低酿酒酵母对果糖的利用,同时缺陷株较野生型表现出一定的生长优势,这为后续以酿酒酵母为宿主生产D-阿洛酮糖奠定了初步基础。     

谷氨酸棒状杆菌果糖代谢阻断工程菌的构建

谷氨酸棒状杆菌不仅可以利用葡萄糖和果糖作为碳源进行糖类代谢,也可以利用这些碳源作为底物生产葡萄糖酸、甘露醇及山梨醇等产品。为了提高底物利用率和目的产物的积累量,利用代谢工程阻断糖类代谢的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（phosphoenolpyruvate carbohydrate phosphotransferase system,PTS）和失活相应磷酸激酶。是实现此目标的有效手段。本实验利用同源重组和反向筛选等技术手段,分别获得ptsF单基因缺失工程菌CGΔptsF和ptsF、ptsH、ptsI三基因缺失工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI。工程菌的生长情况研究表明：在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CGΔptsF和工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI与野生型生长情况基本一致,说明葡萄糖代谢不受3 个基因影响;在以蔗糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CGΔptsF和工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI的生长速率分别是野生型的48.4%和29.7%,菌体浓度分别是野生型的61.6%和34.1%;在以果糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CGΔptsF菌体浓度是野生型43.2%,工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI生长为0,证明其完全阻断了果糖代谢,同时说明果糖的PTS系统受ptsF、ptsH和ptsI基因编码的PTS相关蛋白的联合控制。果糖代谢阻断工程菌的获得,为进一步构建以果糖原型为底物的甘露醇或山梨醇生产工程菌株提供了遗传资源,也为谷氨酸棒状杆菌的糖类代谢研究提供了理论依据。     

ptsG/mglB双基因敲除对大肠杆菌发酵混合糖产L-乳酸的影响

为增强大肠杆菌（Escherichia coli）JH16利用混合糖产L-乳酸的能力,通过Red同源重组技术敲除葡萄糖转运酶基因ptsG和半乳糖转运基因mglB,构建重组菌E. coli JH2705。结果表明,以8%混合糖（5.6%葡萄糖和2.4%木糖）为碳源,ptsG/mglB双基因缺陷重组菌E. coli JH2705同时可利用葡萄糖和木糖,大幅减小葡萄糖效应带来的不利影响,其木糖利用速率为0.60 g/（L·h）,L-乳酸生产强度为1.27 g/（L·h）,较出发菌株E. coli JH16分别提高50%和79.1%,E. coli JH2705的糖酸转化率高达70%,为利用木质纤维素等可再生原料高效生产L-乳酸提供技术参考。     

基于代谢组学分析Slr0643蛋白在调控集胞藻PCC6803葡萄糖混养适应中的重要性

本研究文采用集胞藻PCC6803野生型藻株和Slr0643敲除突变体(Δslr0643)藻株,通过生理实验和基于气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术的植物代谢组学分析,对Slr0643蛋白调控集胞藻PCC6803葡萄糖混养适应的机制进行探讨.在2.5 mM葡萄糖混养条件下,野生型藻株的生长速率较光自养条件明显加快,而Δ...     

Disruption of URA7 and GAL6 improves the ethanol tolerance and fermentation capacity of Saccharomyces cerevisiae

Screening of the homozygous diploid yeast deletion pool of 4741 non-essential genes identified two null mutants (Deltaura7 and Deltagal6) that grew faster than the wild-type strain in medium containing 8% v/v ethanol. The survival rate of the gal6 disruptant in 10% ethanol was higher than that of the wild-type strain. On the other hand, the glucose consumption rate of the ura7 disruptant was better than that of the wild-type strain in buffer containing ethanol. Both disruptants were more resistant to zymolyase, a yeast lytic enzyme containing mainly beta-1,3-glucanase, indicating that the integrity of the cell wall became more resistance to ethanol stress. The gal6 disruptant was also more resistant to Calcofluor white, but the ura7 disruptant was more sensitive to Calcofluor white than the wild-type strain. Furthermore, the mutant strains had a higher content of oleic acid (C18 : 1) in the presence of ethanol compared to the wild-type strain, suggesting that the disruptants cope with ethanol stress not only by modifying the cell wall integrity but also the membrane fluidity. When the cells were grown in medium containing 5% ethanol at 15 degrees C, the gal6 and ura7 disruptants showed 40% and 14% increases in the glucose consumption rate, respectively.     

Properties and Heterologous Expression of the Glucose Transporter GHT1 from Schizosaccharomyces pombe

Genomic DNA of the Schizosaccharomyces pombe glucose transporter, GHT1, was obtained by complementation of the glucose transport deficient Sz. pombe strain YGS-5. Here we describe the GHT1 gene that encodes a protein of 565 amino acids with a corresponding molecular mass of 62·5 kDa. This eukaryotic glucose transporter contains 12 putative transmembrane segments and is homologous to the HXT multigene family of S. cerevisiae with several amino acid motifs of this sugar transporter family. It is also homologous to other sugar carriers from human, mouse and Escherichia coli. The function of the Ght1 protein as a glucose transporter was proved both by homologous and heterologous expression in the Sz. pombe mutant YGS-5 and in the S. cerevisiae hxt mutant RE700A, respectively. Both transformed yeast strains transported d -glucose with substrate specificity similar to that in Sz. pombe wild-type cells. Moreover, the cells of the two transformed yeast strains accumulated 2-deoxy-d -glucose, a non-metabolizable d -glucose analogue, with an efficiency similar to Sz. pombe wild-type cells. The ability of the S. cerevisiae mutant RE700A to accumulate 2DG in an Δμdependent manner after transformation with GHT1 provides evidence that the Sz. pombe transporter catalyses an energy-dependent uptake of glucose. The sequence of GHT1 was deposited at EMBL, Outstation EBI, Accession Number X91218. ©1997 John Wiley & Sons, Ltd.     

酿酒酵母蔗糖关键代谢途径基因的敲除及其生长特性的变化分析

该研究以酿酒酵母（Sacchromyces cerevisiae）IMX581为出发菌株，利用Crispr-Cas9基因编辑的方法敲除其蔗糖消耗途径中的蔗糖转化酶基因Suc2和麦芽糖酶基因MAL32、MAL12、MAL22，构建工程菌株IMX581△Suc2和IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22，并对其生长特性及蔗糖消耗情况进行分析。结果表明，当初始OD600 nm值为0.1时，菌株IMX581△Suc2在以蔗糖为唯一碳源的培养基上仍然可以生长，但培养56 h时，生物量是出发菌株IMX581的52%，而菌株IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22几乎不生长。当初始OD600 nm值为0.1、5.0及10.0时，菌株IMX581△Suc2和IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22培养72 h后，蔗糖的消耗率较出发菌株IMX581均显著下降，分别为28.5%、35.5%、38.5%和7.0%、18.4%、22.5%。因此，成功构建了显著降低蔗糖消耗的菌株IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22，为研究酿酒酵母对蔗糖的利用及调控提供了参考。