常压室温等离子体诱变选育DHA高产菌株

以野生型裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum SR21)为出发菌株,经过常压室温等离子体(ARTP)诱变,碘乙酸、丙二酸及丙二酸-碘乙酸复合平板筛选,摇瓶发酵及GC定量分析选育DHA高产菌株。结果表明:在功率100 W、气流量10 L/min下,经ARTP诱变15 s,以1. 2 g/L丙二酸作为筛选平板,获得一株诱变菌NA2。摇瓶发酵120 h后,其生物量、油脂总量、DHA产量与原始菌株相比分别提高了18. 11%、14. 87%、46. 12%,DHA产量为6. 59 g/L。经5次传代,性状稳定。     

乙酰辅酶A羧化酶对乳酸片球菌耐酸性能的影响

通过对来源于山西老陈醋固态酿造过程中的乳酸菌分离株的耐醋酸性能分析,筛选得到了醋酸耐受性较优的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）AAF3-3,该菌株对其他种类的酸压力（乳酸和盐酸）也表现出一定的耐受性。利用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）对该菌株中乙酰辅酶A羧化酶基因（acc）的转录水平进行分析发现,其在醋酸、乳酸和盐酸下的转录水平分别是无压力条件下的4.32、2.02和1.13倍,均出现了明显上调。进一步构建该基因的过表达菌株并进行耐酸性能分析。结果表明,与对照菌株相比,acc过表达菌株在3种酸压力下的生长性能和存活性能均有所提高,其中,3%（V/V）醋酸条件下培养24 h时过表达菌株的相对活菌数是对照菌株的24倍。这表明乙酰辅酶A羧化酶在乳酸片球菌AAF3-3耐受不同种类的酸压力中发挥着重要作用。     

重组酵母菌N6076的差异表达基因功能及甲羟戊酸代谢分析

为了解重组酵母菌N6076不同发酵时间的差异表达基因信息及甲羟戊酸(mevalonate,MVA)代谢状况,以重组酵母菌N6076及其原始菌株Kh08为研究对象,基于转录组测序和MVA测定,分析和比较了两者在3个发酵时间点(0、48和96 h)的差异表达基因的功能。GO功能分析结果表明,重组菌株N6076新增了14项生物学过程、2项细胞组分和2项分子功能,涉及1140个差异表达基因。KEGG代谢分析结果表明,重组菌株N6076新增了13条代谢通路,涉及77个差异表达基因,其中新增的萜类骨架生物合成途径涉及5个差异表达基因。甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MVK)基因表达与MVA的LC-MS/MS测定结果表明,在整个发酵过程中MVK基因表达量与MVA产量的变化趋势一致。该研究为进一步认识重组酵母菌N6076的基因表达与MVA代谢调控提供了依据。     

果香型葡萄酒酵母的发酵特征与转录组学研究

为揭示果香型酵母香气物质代谢特征及调控机理,以果香型酵母SSF12为研究对象,以另一株果香表现较差的菌株NGF6作为对照,研究它们在葡萄酒发酵过程中的转录组学差异,以及发酵液的理化指标、香气物质含量及感官特性等发酵特征。结果表明：SSF12糖利用度和发酵度高,发酵液中酯类、醇类、萜烯类物质含量高于NGF6,醛类、脂肪酸含量低于NGF6,果香感官特性明显优于NGF6。转录组学分析显示：SSF12相较于NGF6有434个基因差异表达(包括290个上调基因和144个下调基因)。代谢通路分析表明：SSF12在碳水化合物(尤其是糖类、高级醇、酯类)代谢、核酸代谢途径有更多的上调基因,可能表现更突出。NGF6在乙醛合成、脂肪酸合成、部分氨基酸代谢途径的上调基因更多。ADH2,ADH6,ALD3,ATF2等差异表达基因与香气物质代谢密切相关,可作为基因工程改良酵母的研究基因,为果香型酵母的选育与改造提供参考。     

饥饿诱导的魏斯氏菌差异转录组

为探究魏斯氏菌10d-17的代谢途径,初步了解其基因功能,该研究基于转录组测序技术对魏斯氏菌10d-17进行转录组测序和生物信息学相关分析。试验结果表明,共获得10.41 GB的数据,对其进行过滤去冗余后得到Unigene 6 947条,其中Q₂₀(Phred数值大于20碱基占总体碱基的百分比)均在98.36%,高质量reads数为983万～1 359万条;共得到1 018个显著差异表达基因,其中实验组中有509个基因表达上调,509个基因表达下调;差异表达基因中772个基因获得GO(Gene Ontology)功能注释信息,主要富集于RNA代谢过程和药物结合;KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路注释发现,差异表达基因主要富集在生物化学代谢、次生代谢物的生物合成等相关代谢通路,其中富集于糖酵解和丙酮酸代谢通路的显著差异表达基因有13个;该研究为探究魏斯氏菌10d-17的代谢途径,初步了解其基因功能奠定了基础。     

丙酮酸脱氢酶竞争性抑制剂调控裂殖壶菌脂肪酸合成的研究

本研究以合成乙酰辅酶A的丙酮酸脱氢酶复合体为扰动目标,通过应用底物特异竞争抑制剂——氟化丙酮酸(FP)来扰动乙酰辅酶A的合成,在考察扰动后裂殖壶菌的碳消耗、菌体生长、油脂合成、脂肪酸成分的基础上,分析了工业生产二十二碳六烯酸(DHA)菌株——裂殖壶菌中的乙酰辅酶A在普通脂肪酸合成途径(FAS途径)和类聚酮合酶途径(PKS途径)的分配比例变化。结果发现裂殖壶菌可转化利用FP;1 mmol/L FP在抑制总油脂合成的同时也显著改变了乙酰辅酶在FAS和PKS途径中的分配比率;降低了生物质合成,增强了二氧化碳生成量。表明裂殖壶菌的FAS途径对乙酰辅酶A的亲和力可能高于PKS途径;通过降低乙酰辅酶A供给量并不能提高总脂肪酸中多不饱和脂肪酸(DHA和DPA)的含量。这一结果解释了FAS途径和PKS途径的碳流分配调控机制,对于选育DHA高产菌株以及工业发酵过程优化具有重要意义。     

基于转录组学的酿酒酵母耐酸机制解析

酿酒酵母的耐酸特性在果酒生产中至关重要,但目前其应对酸胁迫的生物学机制仍不清楚。该研究以2株酿酒酵母(ET008-c54和ET008)为研究对象,分别提取总RNA后进行转录组测序分析,并考察不同p H条件下2菌株的细胞活力及利用不同的分析方法对ET008-c54发酵性能参数(菌体浓度、葡萄糖含量、生物量、乙酸含量、乙醇含量、甘油含量、麦角甾醇含量和H+-ATPase活性)进行测定。转录组学结果表明,688个差异表达基因中,其中364个基因转录水平上调,324个基因转录水平下调。差异表达基因的GO富集和KEGG通路富集表明,这些基因主要涉及细胞膜的组成及生理功能、麦角甾醇合成、亚铁吸收等多条代谢途径。通过对差异表达基因的进一步分析,最终确定了8个与耐酸性有关的重要基因。另外,ET008-c54在细胞活力、生长速率和代谢产物等方面表现出良好的发酵性能。ET008-c54具有很强的耐酸性,为高酸度水果酒的酿造提供了广阔的前景。这些发现为酿酒酵母的遗传改良提供了方向,同时为果酒的高效发酵提供了重要的理论依据。     

氮离子注入选育高自溶干酪乳杆菌及其肽聚糖水解酶的RT-qPCR分析

通过采用低能N⁺注入对干酪乳杆菌116-a进行诱变,以筛选得到高自溶的干酪乳酸菌突变体,并采用实时荧光定量PCR检测N-乙酰胞壁质酶和N-乙酰氨基葡糖胺糖苷酶在野生菌体和突变体中的表达差异。结果显示:经过离子能量30 keV N⁺注入诱变,在注入剂量0.5×10¹⁵ ions/cm²时,筛选得到遗传稳定性良好的最大正突变菌株,其自溶度为56.3%,最大正突变菌株自溶度比野生型菌株的自溶度提高了25.7%。实时荧光定量PCR检测发现,N-乙酰氨基葡糖苷酶和N-乙酰胞壁质酶在突变体中的表达量比野生菌体中的表达量均有所上调,其中N-乙酰氨基葡糖苷酶表达量上调了约55倍,而N-乙酰胞壁质酶的表达量仅上调2.8倍。因此,N-乙酰氨基葡糖苷酶在干酪乳杆菌116-a自溶中起着重要作用,该酶表达量的上调可以有效提高菌体的自溶。     

植物乳杆菌FS5-5在盐胁迫下的转录组学分析

以分离自东北自然发酵大酱中的一株耐盐植物乳杆菌FS5-5(Lactobacillus plantarum FS5-5)为实验对象,在转录水平上对该菌株盐胁迫相关基因表达进行了研究。结果表明:在对数生长期,表达显著下调的共29个基因,分别为参与碳水化合物转运和代谢的4个基因,氨基酸转运和代谢的9个基因,维生素代谢的3个基因,核苷酸代谢的6个基因,遗传信息翻译、核糖体结构和形成的7个基因;表达显著上调的有参与碳水化合物转运和代谢的4个基因。这些变化可能与L.plantarum FS5-5的盐胁迫机制密切相关。选取参与维生素代谢的3个基因和核苷酸代谢的1个基因,通过实时定量聚合酶链式反应对转录组学结果进行验证,结果表明两种方法中基因表达趋势一致。实验对L.plantarum FS5-5的盐胁迫反应进行了比较全面的分析,为提高工业生产中菌株的耐受性提供了理论依据。     

橄榄苦苷改善db/db小鼠糖尿病的肝脏转录组学及生物信息学分析

通过转录组学及其生物信息学分析,研究了橄榄苦苷缓解db/db小鼠糖尿病的肝脏差异表达基因及相关信号通路。结果发现与db/db对照组相比,橄榄苦苷处理组的539个基因发生显著变化,其中450个基因显著上调,89个基因显著下调。将上调和下调的差异表达基因在基因本体论数据库中注释,这些差异表达基因主要在细胞过程、细胞部分和结合中分布。京都基因与基因组百科全书通路富集分析结果显示上调的差异表达基因主要富集在磷酸肌醇3-激酶-蛋白激酶B信号通路途径,该通路共涉及27个差异表达基因;下调的差异表达基因主要富集在花生四烯酸代谢和真核生物中核糖体的生物发生信号通路途径,分别涉及4个差异表达基因。本研究为进一步阐明橄榄苦苷缓解2型糖尿病的分子机制奠定了基础。     

高产DHA裂壶藻突变株的选育

利用60Co-γ射线辐照诱变裂壶藻（Schizochytrium limacinum）ATCC20888,以平板生长情况、生物量、含油率和二十二碳六稀酸（DHA）产量为综合指标,最终选育出一株高产突变株,命名为1.6-7-1,其摇瓶发酵生物量为47.37 g/L,油脂含量为31.41%,DHA产量为5.65 g/L,且DHA产量较出发菌株提高了约40%,经连续5代发酵培养,其遗传性能稳定。     

基于基因测序鱼露发酵橘青霉YL-1鉴定及安全性评价

目的：为弥补传统方法在检测菌株产毒素上的不足,用基因组方法分析橘青霉YL-1（Penicillium citrinum YL-1,P. citrinum YL-1）物质生物合成途径及关键基因,以此评价P. citrinum YL-1在鱼露发酵生产过程中的安全性。方法：应用ITS基因测序鉴定菌株,利用Illumina平台Hiseq测序技术对菌株YL-1进行基因组survey测序,通过生物信息分析产青霉毒素、黄曲霉毒素及典型丝状真菌毒素的非核糖体多肽合成代谢、聚合酮酶代谢、聚合酮酶-非核糖体多肽联合代谢、萜类化合物代谢和氨基酸相关代谢途径及基因,考察菌株YL-1产真菌毒素能力,判断其是否存在产真菌毒素的潜在危害。结果：ITS鉴定菌株YL-1与P. citrinum同源性99%,survey测序结果表明P. citrinum YL-1全基因组大小为31.92?Mb,GC为46.27%。利用Maker2基因预测技术得到预测基因11?980?个。其中,被KOG注释基因5?417?个,被COG注释基因4?946?个;比对KEGG数据库被注释通路323?条,注释基因3?525?个。代谢分析表明,注释到可能产真菌毒素相关的代谢途径有5?条,仅注释到1?种产黄曲霉毒素代谢途径的同源基因Afld及其他5?种相关基因,但并未注释到其完整代谢途径。结论：ITS基因测序鉴定菌株YL-1为P. citrinum,P. citrinum YL-1基因注释存在1 种产黄曲霉毒素的同源基因及其他5?种相关基因,虽不存在完整代谢链,但P. citrinum YL-1运用于鱼露及相关产品的发酵安全性仍值得进一步考察。     

低能离子注入诱变酿酒酵母菌胞外代谢产物的差异性分析

基于代谢组学方法研究低能离子束诱变重组菌株N6076与原始菌株Kh08在不同发酵时期的差异性胞外代谢产物,并通过网络药理学探讨了相关代谢通路。结果表明,不同时期两种菌株的胞外代谢产物存在明显差异,鉴定出VIP1的15种代谢差异物,其中吲哚3-丙酸不仅作为共同的代谢产物,而且其差异性也最为显著。基于网络药理学的差异代谢物的通路分析,结果表明该重组菌株中有四条代谢通路存在显著性差异,分别是:醚脂代谢、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定生物合成、泛酸和Co A的生物合成、甘油磷脂。论文研究为进一步认识重组酵母菌的代谢差异提供了科学依据,为下一步的菌种改良提供可能的驯化方向。     

出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的代谢通量及关键酶活性分析

野生型出芽短梗霉菌株TKPM00006及其诱变菌株CGMCC30007在相同条件下,使用5 L罐进行聚苹果酸发酵,分析这2株菌在相同发酵状态下发酵中后期代谢网络的代谢流分布和关键酶活变化,对出芽短梗霉合成聚苹果酸的机理进行探究。结果表明,菌株TKPM00006和菌株CGMCC30007的菌体生长情况相似,但产酸量分别为20.54 g/L和30.2 g/L。.通过代谢通量分析及关键酶活性的测定可知,丙酮酸羧化途径及乙醛酸途径是PMLA合成的主要途径,TCA循环途径在发酵后期比较弱,该结论通过添加代谢抑制剂及中间代谢物实验加以证明。酶活分析同时还证明了高产菌株比出发菌株的PMLA合成能力强主要是因为丙酮酸羧化途径的加强。根据实验分析可在丙酮酸节点进行靶点改造或通过发酵调控改变丙酮酸节点处碳架的分配,通过加强丙酮酸羧化途径来减少因副产物的生产而造成的碳架流失,达到增加聚苹果酸生物合成的目的。     

基于代谢组学分析Slr0643蛋白在调控集胞藻PCC6803葡萄糖混养适应中的重要性

本研究文采用集胞藻PCC6803野生型藻株和Slr0643敲除突变体(Δslr0643)藻株,通过生理实验和基于气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术的植物代谢组学分析,对Slr0643蛋白调控集胞藻PCC6803葡萄糖混养适应的机制进行探讨.在2.5 mM葡萄糖混养条件下,野生型藻株的生长速率较光自养条件明显加快,而Δ...     

Innovative metabolic pathway design for efficient l-glutamate production by suppressing CO2 emission

In the pathway of L-glutamic acid (L-Glu) biosynthesis in Corynebacterium glutamicum, 1 mol of L-Glu is synthesized from 1 mol of glucose at a cost of 1 mol of carbon dioxide (CO(2)), with a maximum theoretical yield of 81.7% by weight. We have designed an innovative pathway for efficient L-Glu production employing phosphoketolase (PKT) to bypass the CO(2)-releasing pyruvate dehydrogenase reaction, thereby increasing the maximum theoretical yield of L-Glu from glucose to up to 98.0% by weight (120% mol/mol L-Glu produced/glucose consumed). The xfp gene encoding PKT was cloned from Bifidobacterium animalis and overexpressed under the strong cspB promoter in C. glutamicum. A functional enzyme was detected in an L-Glu-producing strain of C. glutamicum (odhA). When cells of this producer strain with the xfp gene and those without the xfp gene were cultivated in a controlled fermentation system, the L-Glu production yield of the strain expressing the xfp gene was much higher than that of the original strain, coupled with the suppression of CO(2) emission. Consequently, we could successfully enhance L-glutamate production by installing the PKT pathway of B. animalis into C. glutamicuml-Glu metabolism, and this novel metabolic design will be able to increase L-Glu production yield beyond the maximum theoretical yield obtained from the conventional metabolic pathway of biosynthesis from glucose.     

Isolation and characterization of styrene metabolism genes from styrene-assimilating soil bacteria Rhodococcus sp. ST-5 and ST-10

Styrene metabolism genes were isolated from styrene-assimilating bacteria Rhodococcus sp. ST-5 and ST-10. Strain ST-5 had a gene cluster containing four open reading frames which encoded styrene degradation enzymes. The genes showed high similarity to styABCD of Pseudomonas sp. Y2. On the other hand, strain ST-10 had only two genes which encoded styrene monooxygenase and flavin oxidoreductase (styAB). Escherichia coli transformants possessing the sty genes of strains ST-5 and ST-10 produced (S)-styrene oxide from styrene, indicating that these genes function as styrene degradation enzymes. Metabolite analysis by resting-cell reaction with gas chromatography-mass spectrometry revealed that strain ST-5 converts styrene to phenylacetaldehyde via styrene oxide by styrene oxide isomerase (styC) reaction. On the other hand, strain ST-10 lacked this enzyme, and thus accumulated styrene oxide as an intermediate. HPLC analysis showed that styrene oxide was spontaneously isomerized to phenylacetaldehyde by chemical reaction. The produced phenylacetaldehyde was converted to phenylacetic acid (PAA) in strain ST-10 as well as in strain ST-5. Furthermore, phenylacetic acid was converted to phenylacetyl-CoA by the catalysis of phenylacetate-CoA ligase in strains ST-5 and ST-10. This study proposes possible styrene metabolism pathways in Rhodococcus sp. strains ST-5 and ST-10.