家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位

在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426.该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj.Bmbzj基因全长661bp,由99 bp的5'端非翻译区序列(5'UTR)、486 bp的开放读码框(ORF)和76 bp的3'端非翻译区序列(3'UTR)组成.生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽.将该基因插入到载体pGEX-4T-3中,构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3-Bmbzj,转化大肠杆菌Rosetta后,IPTG诱导表达了该融合蛋白,并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体.亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中.     

RACE技术对薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA 3'末端的快速扩增

对微生物Absidia sp.G3d产薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA 3'末端的序列进行了调取.根据薯蓣皂苷糖苷酶基因的CDS区已知序列设计特异性引物,应用3'RACE(Rapid-Amplification of eDNA 3'Ends)技术,快速扩增得到cDNA 3'端未知序列片段,将PCR产物切胶回收,直接测序得到长度为258 bp的产物序列,经比对其中编码区长度为122 bp,非编码区长度为136 bp,Poly A部分长度为28 bp.这对其他类中草药高活性皂苷糖基水解酶基因cDNA3'末端的序列的调取提供了参考.     

家蚕BmLITAF基因的克隆表达及生物信息学分析

在对家蚕蛹cDNA文库进行分析时,发现一条与脂多糖诱导肿瘤坏死因子α的转录激活因子LITAF的保守结构域同源的保守序列。基因序列全长为981 bp,由97 bp的5端非翻译区序列(5 UTR)、390 bp的开放读码框(ORF)和494 bp的3端非翻译区序列(3 UTR)组成。利用生物信息学方法对BmLITAF进行基因结构分析发现,此基因由3个外显子和2个内含子组成,编码129个氨基酸残基;其预测理论分子量为13.9 kDa,预测等电点6.47;在90~100位氨基酸残基区域具有较高的疏水性,具有跨膜结构域;定位细胞内的可能性较大。根据BmLI-TAF的cDNA序列进行PCR扩增获得目的基因,将其克隆到质粒pGEX-4T-3中,测序验证克隆正确。经IPTG诱导,结果发现目的蛋白主要以包涵体的形式存在。     

RACE技术对薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA3′末端的快速扩增

对微生物Absidia sp.G3d产薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA3′末端的序列进行了调取。根据薯蓣皂苷糖苷酶基因的CDS区已知序列设计特异性引物,应用3′RACE(Rapid-Amplification of cDNA 3′Ends)技术,快速扩增得到cDNA 3′端未知序列片段,将PCR产物切胶回收,直接测序得到长度为258 bp的产物序列,经比对其中编码区长度为122 bp,非编码区长度为136 bp,Poly A部分长度为28 bp。这对其他类中草药高活性皂苷糖基水解酶基因cDNA3′末端的序列的调取提供了参考。     

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的cDNA 5′末端的快速扩增

根据人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的CDS区已知序列设计引物,应用"去帽法"原理快速扩增出了人参皂苷-α-鼠李糖苷酶cDNA 5′端未知序列.测序结果表明,扩增出的5′端未知序列长度为421 bp.通过与已知的CDS区序列比对,确定扩增出的5′端未知序列就是目的序列,其5′端非编码区长度为61 bp.     

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的cDNA5’末端的快速扩增

根据人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的CDS区已知序列设计引物，应用“去帽法”原理快速扩增出了人参皂苷-α-鼠李糖苷酶cDNA5’端未知序列．测序结果表明，扩增出的5’端未知序列长度为421bp．通过与已知的CDS区序列比对，确定扩增出的5＇端未知序列就是目的序列，其5’端非编码区长度为61bp．     

利用SMART RACE克隆STGA3 cDNA的5′末端

阐述了SMART RACE的原理,克隆了草莓贝壳杉烯氧化酶基因(STGA3)5′端未知序列。所得到的STGA3 cDNA的5′末端共有1 474 bp,其中非编码区共34 bp,编码区1 440 bp,编码氨基酸480个,此序列在NCBI的注册号为:AY462247。它与已克隆到的同源基因拟南芥GA3和南瓜CYPT01A1之间的同源性分别为56.9%和59.2%。     

真菌产人参皂苷葡萄糖苷酶基因的调取

根据已知的人参皂苷糖苷酶(GluGF)的N端氨基酸序列设计简并引物,从Absidia Sp.R84g菌株的总RNA出发,应用RACE技术,快速扩增测序得到cDNA3′末端与cDNA5′末端的未知序列,利用扩增测序所得到的cDNA5′末端和cDNA3′末端的序列设计引物,进行二次RT-PCR扩增并测序得到GluGF基因的全序列。回收PCR产物测序,得到GluGF基因的序列全长为2149 bp,其中5′UTR长度为82 bp,3′UTR长度为114 bp,GluGF的CDS区序列全长为1 923 bp,所编码的氨基酸序列的长度为640个氨基酸。     

海刺参组织蛋白酶L基因的克隆、重组表达及活性鉴定

通过RT-PCR和RACE PCR技术,从海刺参(Stichopus japonicus)肠中克隆得到编码组织蛋白酶L(SjCL)基因,其中全长cDNA 1 287 bp,5′非编码区(UTR)202 bp,3′UTR 87 bp,开放阅读框(ORF)999 bp,编码332个氨基酸(aa),包括组织蛋白酶L成熟肽316 aa和信号肽16 aa,分子质量预测为35.3 ku。用SjCL序列与相似物种海胆、海葵等进行对比,可知SjCL具有组织蛋白酶L所特有的氨基酸保守区域ERFNIN和GNFD,以及由Cys 139,His 278和Asn 299残基组成的保守活性位点。将编码SjCL基因克隆进原核表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-SjCL,转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞,再进行诱导表达、亲和纯化和透析复性,得到了纯化且具有活性的重组SjCL。酶活力检测结果表明,重组SjCL对组织蛋白酶L特异性底物Z-Phe-Arg-Nmec具有较高活性,而对组织蛋白酶B特异性底物Z-Arg-Arg-Nmec无活性。本实验对SjCL的cDNA序列进行了生物信息学分析并通过基因工程的手段表达出具有活性的重组SjCL,为进一步研究组织蛋白酶L在海刺参自溶过程中的作用提供理论基础。     

海刺参组织蛋白酶L基因的克隆、重组表达及活性鉴定

通过RT-PCR和RACE PCR技术,从海刺参(Stichopus japonicus)肠中克隆得到编码组织蛋白酶L(SjCL)基因,其中全长cDNA 1 287 bp,5′非编码区(UTR)202 bp,3′UTR 87 bp,开放阅读框(ORF)999 bp,编码332个氨基酸(aa),包括组织蛋白酶L成熟肽316 aa和信号肽16 aa,分子质量预测为35.3 ku。用SjCL序列与相似物种海胆、海葵等进行对比,可知SjCL具有组织蛋白酶L所特有的氨基酸保守区域ERFNIN和GNFD,以及由Cys 139,His 278和Asn 299残基组成的保守活性位点。将编码SjCL基因克隆进原核表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-SjCL,转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞,再进行诱导表达、亲和纯化和透析复性,得到了纯化且具有活性的重组SjCL。酶活力检测结果表明,重组SjCL对组织蛋白酶L特异性底物Z-Phe-Arg-Nmec具有较高活性,而对组织蛋白酶B特异性底物Z-Arg-Arg-Nmec无活性。本实验对SjCL的cDNA序列进行了生物信息学分析并通过基因工程...