皮肤致敏替代方法LuSens的建立与应用

建立皮肤致敏性体外检测方法 LuSens试验,同时评估该方法对我国化妆品原料致敏反应应用的可行性。参考OECD TG442D(Test Guideline No. 442D)标准指南建立方法,确定试验可转移性。对13种化妆品原料组分进行检测,其中10种受试物结果与小鼠局部淋巴结试验（local lymph node assay,LLNA）方法的结果一致,与LLNA相比总体准确性为83%(10/12);11种受试物结果与人体数据一致,与人体数据相比总体准确性为100%(11/11)。成功建立了LuSens检测方法并用于部分化妆品原料的致敏性检测,可较好地筛选皮肤化学致敏原。     

组合应用替代方法评价5种化妆品中常用防腐剂的皮肤致敏性

采用基于不良反应结局路径（AOP）开发的体外致敏性检测方法对5种常用防腐剂进行皮肤致敏性评估。根据整合测试和评估方法（IATA）的3选2原则,使用直接多肽反应试验（DPRA）和人细胞系活化试验（h-CLAT）分别对化妆品中常用的防腐剂苯氧乙醇、4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸丙酯、咪唑烷基脲和DMDM乙内酰脲进行检测。其中,直接多肽反应试验和人细胞系活化试验参照OECD 442C/442E指南的内容进行。实验结果显示,苯氧乙醇、4-羟基苯甲酸甲酯在DPRA和h-CLAT中均为阴性;咪唑烷基脲和DMDM乙内酰脲在2个试验中均表现出阳性结果;而4-羟基苯甲酸丙酯在DPRA中为阴性,h-CLAT中为阳性。该研究结果表明,甲醛释放体类防腐剂咪唑烷基脲和DMDM乙内酰脲是皮肤致敏物,而苯氧乙醇和4-羟基苯甲酸甲酯不是皮肤致敏物,基于文献调研结合更多的实验数据判定4-羟基苯甲酸丙酯为非致敏物。DPRA和h-CLAT的组合测试弥补了单一方法检测的局限性,适用于化妆品原料皮肤致敏性的初筛。     

90%杀鼠新原药皮肤致敏试验研究

本试验以豚鼠为实验动物,进行了９０％杀鼠新原药皮肤致敏试验。试验采用斑贴法,使用豚鼠５０只,雄雌各半,试验共分４组;第１、２组为受试致敏组和对照组（凡士林）,均为２０只动物,第３、４组为阳性物致敏组和对照组（８０％乙醇）,均为５只动物。剂量设计为第１、２组致敏及激发浓度均为５０％,第３、４组致敏及激发浓度分别为０．２％和０．０５％的２,４－二硝基氯苯。试验期间对各受试动物的一般状态,给药部位的皮肤     

KeratinoSensTM方法在化妆品皮肤致敏性评价中的研究进展

阐述了一种目前已被OECD收录的体外皮肤致敏替代方法KeratinoSens^TM及其实验原理;重点综述KeratinoSens^TM方法在预测化妆品中过敏原,如香料、植物提取物、金属纳米材料等对皮肤致敏性的发展现状,讨论了该方法对化妆品中过敏原与刺激物组合时致敏阈值的评估,以及对其与其他测试方法的整合策略展开论述,同时还对该方法在动物替代的发展进行展望,为后续选择合适的体外检测方法用于化妆品原料和成品的致敏评价提供参考。     

皮肤致敏测试动物替代方法DPRA的建立和应用

皮肤致敏是化妆品原料安全性评估中的一项重要内容。按照ECVAM(European Centre for the Validation of Alternative Methods)的标准,通过对16个标准品进行检测,成功建立了DPRA(Direct Peptide Reaction Assay,直接肽链反应分析)实验方法。其检测结果的敏感性,特异性,准确性,S/NS的判定以及4 Class分别为81.82%,100%,77.8%,100%和94.7%。目前该方法已成功运用在实际工作中,并检测出多款具有引起皮肤致敏潜在能力的化妆品原料。     

基于超高效液相色谱的改良直接肽反应试验预测化学物皮肤致敏性

建立基于超高效液相色谱改良直接肽反应试验预测化学物致敏性并提高检测效率和通量。选择8种已知皮肤致敏性化合物与半胱氨酸多肽或赖氨酸多肽反应24 h,通过基于超高效液相色谱或高效液相色谱的检测系统计算得到多肽消耗率预测受试物皮肤致敏性。结果显示,基于超高效液相色谱的改良直接多肽反应试验能正确区分8种化学物为皮肤致敏物或非致敏物,且节省检测时间,提高检测通量,同时色谱峰分离度更高。     

应用DPRA替代方法评价3种香豆素类化合物的皮肤致敏性

应用直接多肽反应试验（DPRA）方法,对化妆品植物提取物原料中存在的蛇床子素、滨蒿内酯、东莨菪内酯3种未知致敏性的香豆素类化合物进行评价。3种香豆素类化合物与半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽模拟的皮肤蛋白共同孵育,使用高效液相色谱法检测3种化合物的多肽消耗率。在标准色谱条件下,蛇床子素和滨蒿内酯与两种多肽的反应体系峰型均正常,东莨菪内酯与赖氨酸反应体系峰型异常,以体积分数0.1%的甲酸水-乙腈流动相体系对标准流动相体系进行优化后检测。结果表明：蛇床子素与半胱氨酸反应体系在反应24 h前产生沉淀,致敏性结果为不确定;滨蒿内酯多肽消耗率均值为6.95%,判定致敏性为阳性,反应等级为弱反应;东莨菪内酯的半胱氨酸多肽消耗率为75.82%,优化色谱条件后的赖氨酸多肽消耗率为80.46%,判定致敏性为阳性,反应等级为中度反应。阳性和阴性对照化合物的结果均与小鼠淋巴结试验（LLNA）致敏性结果一致,实验结果可为3种香豆素类化合物的致敏性提供参考和依据。     

基于皮肤模型与THP-1细胞共培养建立皮肤致敏体外检测方法的初步研究

建立了皮肤模型与THP-1细胞共培养方法,对石化产品进行了致敏性评价。不同浓度测试物与表皮模型作用15 min,去除受试物后孵育6 h,使用MTT法检测皮肤模型组织活率,利用流式细胞法检测THP-1细胞表面标志物CD86、CD54表达变化情况以及细胞活率。对上述参数进行统计学分析及是否存在剂量效应关系,判定测试物是否具有潜在致敏特性。对SLS、肉桂醛、柠檬醛的测试表明,该方法可以正确区分刺激物和致敏物;对4种未知润滑油添加剂的预测结果表明,HVI60、Cuvan826、ATM PAN为非致敏物,Irgamet30为致敏物,高浓度时可导致表皮组织和THP-1细胞活性降低及表面标志物CD86、CD54的特异性升高。     

采用DPRA替代方法评价3种香料的皮肤致敏性

采用直接肽反应试验(DPRA)对新铃兰醛、氯化苔黑醛和苔黑醛3种香料的致敏性进行评价.在本实验室建立DPRA方法,采用高效液相色谱仪测定新铃兰醛、氯化苔黑醛和苔黑醛及其他6种已知致敏性化合物的多肽消除率,并进行皮肤致敏性的预测判定.通过比较DPRA和小鼠局部淋巴结试验(LLNA)结果的一致性,判断方法的可行性,并最终判...     

化妆品皮肤保湿功能评价方法的研究

为了寻找一种操作简便和科学性较强的化妆品原料及成品人体皮肤保湿功能评价方法，作者运用Corneometer在6组共175名健康受试者中对27种试验物（7种具有保湿功能的化妆品原料和5种有保湿功能的成品）进行检测并将结果分析研究，建立了一种皮肤保湿功能的客观评价方法，发现该方法完全能分辨各种不同原料和成品保湿功能的大小，而且适用于各种剂型，提示用Corneometer来评价保湿功能是一种具有较高敏感性，重复性和适应性的客观评价方法。     

揭秘化妆品安全性评价技术（六）——化妆品的皮肤刺激／腐蚀性及试验方法

皮肤刺激性是日常使用化妆品最常见的不良反应之一。皮肤刺激性试验是化妆品原料及产品安全性评价的主要项目。传统皮肤刺激试验采用实验动物进行。近年来。多种替代动物试验的体外模型被开发和应用。     

化妆品光刺激性和光致敏性的安全评价方法进展

阐述了光刺激和光致敏的定义、区别与联系,从光化学反应、细胞、组织和器官模型、动物和人体试验等不同水平介绍了国内外常用的试验评价方法及进展,比较分析了各方法的适用范围和优缺点,并对目前化妆品皮肤光敏感研究的挑战和发展趋势进行了总结和展望。     

实时荧光定量PCR方法检测人癌组织中RFP蛋白的表达

目的检测RFP(Ret finger protein)蛋白在人正常组织及人癌组织中的分布。方法采用实时荧光定量PCR方法,以18 S rRNA为内对照,检测RFP在人正常组织及人癌组织中的表达水平。结果RFP表达水平子宫颈鳞状细胞癌组织高于正常子宫颈组织,子宫内膜腺癌组织高于正常子宫内膜组织,胃腺癌组织高于正常胃组织,食管鳞状细胞癌组织高于正常食管组织,而子宫内膜腺癌组织高于子宫颈鳞状细胞癌组织,胃腺癌组织高于食管鳞状细胞癌组织,脑癌组织高于正常脑组织。结论RFP可能成为治疗恶性肿瘤的一个潜在的分子靶点。     

基于图像的皮肤纹理评价算法研究

皮肤表面纹理或微轮廓的量化评价对抗皱宣称的化妆品功效评价有重要意义。基于皮肤美容领域的应用需求和日常生活的实际需要,结合图像处理领域的相关算法,对皮肤的基础纹理特征展开了研究。首先,将实验实测的皮肤图像转为灰度图像,再通过对比度受限的自适应直方图均衡化对图像进行增强,之后通过高斯滤波去除图像的噪声,再采用维纳滤波对纹理的细节信息进行增强,得到纹理清晰的皮肤图像。通过实验确定适合于皮肤纹理评价的灰度共生矩阵的灰度级数和距离,基于灰度共生矩阵算法对皮肤纹理进行统计分析,提出了基于4个纹理特征参数的综合指标数学模型,并应用该模型对全部皮肤图像进行了纹理特征定量评价,同时也由专家对这些皮肤图像进行视觉盲评,2种评价方法一致性良好。     

荧光定量PCR法检测人乳腺珠蛋白与乳腺癌微小转移诊断的研究

目的克隆人乳腺珠蛋白(hMaM)基因,建立荧光定量PCR方法,探讨外周血hMaM mRNA的表达作为乳腺癌血行微小转移标志物的可能性。方法设计特异引物,用RT-PCR方法从乳腺癌组织扩增获得目的片段,利用T/A克隆将PCR产物插入pMD-18T载体,优化扩增条件,以pMD/M质粒制备标准曲线,建立FQ-PCR方法,对乳腺癌不同分期的患者(n=28),乳腺良性疾病患者(n=15),其他肿瘤患者(n=33)的外周血进行检测。结果成功获得hMaM基因并完成克隆,阳性克隆测序结果与预期序列一致;建立了FQ-PCR检测hMaM mRNA方法;28例乳腺癌病人中9例(32.1%)阳性(Ⅰ期4例,Ⅱ期3例,Ⅲ期1例,Ⅳ期1例),hMaM mRNA的表达与乳腺癌病理分期无关(χ~2=0.5936;P>0.05);乳腺良性疾病组,其他肿瘤病人组及对照组外周血中均未检出hMaM mRNA。结论hMaM mRNA是乳腺癌特异性标志物,其外周血的表达可作为乳腺癌血行微小转移的指标。     

人干扰素诱导跨膜蛋白基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立人干扰素诱导跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane protein,IFITM)1、2、3基因实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GenBank中登录的人IFITM1、2、3及β-actin基因序列,分别设计4对特异性引物,以质粒pVAX1-IFITM1、2、3和pMD18-T-β-actin为模板,分别进行PCR及实时荧光定量PCR扩增,优化实时荧光定量PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线及扩增曲线,建立实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的重复性、灵敏度及特异性。结果各质粒的PCR及实时荧光定量PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析,均可见大小与理论值相符的特异性条带。IFITM1、2、3和β-actin的最佳荧光定量PCR引物浓度分别为0.2、0.5、0.4和0.5μl,最佳退火温度为55℃。各质粒标准曲线的循环数与起始模板拷贝数的相关性均较好(R2分别为0.998、0.990、0.990和0.995),扩增效率分别为106.284%、101.030%、104.929%和101.962%。IFITM1、2、3基因不同拷贝数的试验内CV为0.14%-0.72%,试验间CV为0.77%-1.58%;灵敏度分别为2.52×100、1.3×100和3.7×101copies;该方法未扩增出鸡肝脏及禽流感病毒H3N2 cDNA,可特异性扩增B型流感病毒cDNA,各标准质粒的溶解曲线约在同一温度出现1个单峰。结论已成功建立了IFITM1、2、3基因实时荧光定量PCR检测方法,该方法具有较高的重复性、灵敏度及特异性,为进一步研究IFITM1、2、3的功能及其基因表达与肿瘤发生发展的相关性奠定了基础。     

洗洁精对人皮肤成纤维细胞损伤刺激的研究

借助人体皮肤纤维细胞损伤刺激实验,通过MTT显色图和细胞结晶紫染色图分析了洗洁精对人体皮肤的影响。     

长效重组人生长激素纯化液中CHO-K1细胞残留DNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立检测CHO-K1细胞表达长效重组人生长激素(Fc-recombinant human growth hormone,Fc-rhGH)纯化液中残留DNA的实时荧光定量PCR方法,并进行验证。方法提取CHO-K1细胞基因组DNA,特异性PCR扩增后,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,以其为标准品,建立实时荧光定量PCR检测方法;并对方法进行灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性及耐用性验证。结果建立的方法灵敏度可达2. 6×10~1 copies/μL。标准曲线的回归方程为y=-3. 487 x+30. 201,R~2=0. 999;检测样品中DNA回收率在73. 56%～101. 87%范围内,RSD均小于10%;该方法可特异性扩增CHO-K1细胞的基因组DNA,而Vero细胞、MDCK细胞、Wish细胞及大肠埃希菌等基因组DNA均未见明显的扩增;样品精密度测定Ct的RSD在0. 4%～2. 95%之间;于两种不同PCR仪器上检测标准品,扩增效率分别为98%、99%,相关系数R~2均为0. 999。结论成功建立了一种检测CHO-K1细胞表达Fc-rhGH纯化液的残留DNA的实时荧光定量PCR方法,该方法具有较好的灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性和耐用性。