噬琼胶菌产新琼二糖热稳定琼胶酶的酶学性质及酶解产物的抗氧化活性

利用PCR从噬琼胶菌AL1中扩增琼胶酶基因,将其克隆至表达载体pET-28a;表达产物用亲和层析纯化,研究重组酶的酶学性质;利用薄层色谱和质谱鉴定酶解产物,并测定酶解产物的还原能力和清除DPPH、ABTS+和·OH自由基的能力,分析酶解产物的抗氧化活性.结果表明,来自噬琼胶菌AL1重组琼胶酶的分子质量为105 ku.该...     

海洋细菌NBRC10260产琼胶酶发酵条件优化

通过正交试验法对产琼胶酶海洋菌株NBRC102603发酵条件进行优化,优化培养基为:蛋白胨4.0g/L、酵母粉1.25g/L、琼胶粉5.0g/L;在装液量150mL(500mL三角瓶)、28℃、150r/min、接种量为1%条件下发酵48h酶活力达到最高,为56.89U/mL,比未优化前提高了2.01倍.     

一株琼胶降解菌的筛选、鉴定及粗酶学性质

本研究通过初筛、复筛从青岛近海沉积物中分离出一株具有琼胶酶活性的菌株,该菌的最佳发酵时间为26 h,对该菌培养基进行卢戈氏碘液染色后菌落周围出现明显透明圈,镜检观察菌株的革兰氏染色结果表明,该菌为革兰氏阴性菌。经过鉴定,该菌株为不动杆菌（Acinetobacter sp.）,命名为Acinetobacter sp.LXK,对该菌的粗酶学特性进行初步研究,结果显示,该酶的最适反应温度为40℃,最适底物浓度为0.5%,最适反应体系p H为8.0,K⁺和Ca²⁺对酶解反应有促进作用,Fe²⁺、Mn²⁺和Ba²⁺对酶解反应有不同程度的抑制作用。      

海洋细菌Sphingomonas sp. Q2产琼胶酶发酵条件优化、酶学性质及降解产物研究

本研究旨在对从江蓠中筛选获得的Sphingomonas sp. Q2菌株产琼胶酶能力条件进行优化并对其酶学性质及降解产物进行研究。通过响应面法对发酵条件进行优化,采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶层析等方法对发酵所得酶液进行纯化并对纯化后的酶液进行酶学性质研究。发酵优化结果表明该菌株产琼胶酶的最佳培养基组成为：琼脂4.42 g/L、磷酸氢二钾1.30 g/L、氯化钠10.51 g/L。优化后的酶活力为1085.71 U/mL,较优化前提高了1.58倍。纯化后的琼胶酶比活为112048.82 U/mg,纯化倍数为7倍,回收率为48.04%。酶学性质结果表明该酶最适反应温度为40℃,最适pH为6.5,且在最适温度下保存8 h,酶活仍保持在90%以上。MS和¹³C-NMR结果表明,该琼胶酶的降解产物主要为新琼四糖。该琼胶酶具有良好的热稳定性及较高的酶活力,为琼胶寡糖的开发制备提供了基础。     

海洋细菌产琼胶酶的条件优化

研究了一株高产琼胶酶的海洋细菌多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriummultivorumd)的最佳产酶条件,主要包括氮源、碳源、起始pH、温度、盐浓度和添加物等对产酶的影响,试验确定的最佳培养基组成为:NaCl2.0%;蛋白胨0.8%;MgS04·7H2O0.5%;KCl0.1;FeS04·7H2O0.002%;CaCl20.02%;NaH2PO40.06%;琼胶0.3%。该菌株产酶的最佳发酵条件为20℃,起始pH7.0下培养15h。经培养条件的优化后,菌株产酶活力高达18.4U/mL,较优化前提高了14倍,为酶的大量生产和活性琼胶低聚糖的酶法制备创造了条件。     

来源于Wenyingzhuangia属海洋细菌的一种β-琼胶酶的克隆表达及性质研究

琼胶是一种重要的海洋多糖,其寡糖被证实具有丰富的生理调节功能。该研究拟从微生物基因组出发,利用生物信息学及分子生物学技术发掘新型琼胶酶。以海洋细菌Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127~T为实验材料,从该菌的基因组中发掘出1条潜在的GH16家族β-琼胶酶编码基因序列aga16A,通过分子克隆、异源表达及分离纯化,证实其编码的蛋白Aga16A_Wf具有琼胶酶活力。酶学性质及作用方式分析表明,Aga16A_Wf的最适反应温度(50℃)高于琼胶的凝胶温度,且该酶展现出适冷性;Aga16A_Wf的动力学常数K_m为3.6 g/L,K_(cat)为287.88 s~(-1);该酶为内切型水解酶,最小作用底物为四糖,最小产物为二糖。Aga16A_Wf可作为高效制备琼胶寡糖的工具酶,该酶的获取为琼胶及琼胶寡糖的进一步研究与应用提供了良好支撑。     

一株海洋细菌产几丁质酶培养条件研究

从海洋环境中筛选出1株产几丁质酶细菌B-25。进行不同碳源、氮源、温度、pH值等对B-25菌株发酵产生几丁质酶的影响试验,研究几丁质酶的培养条件。该菌株产酶最佳碳源为甘露醇,最佳氮源为蛋白胨,通过培养条件优化,该菌株酶活力达到0.43U/mL,较始发菌株提高了4.9倍。     

琼胶酶及其综合应用的研究概况

琼胶酶是一组能降解琼胶多糖的酶，主要有α-琼胶酶、β-琼胶酶两种类型，降解产物在很多方面有独特的活性，除此以外，琼胶酶在分子生物学方面也多有应用，本文从琼胶酶的种类及作用机理、来源，分子生物学研究状况以及应用等方面概述了琼胶酶的研究进展。     

产琼胶酶菌株Agarivorans sp.FG15的筛选鉴定与酶学性质

从中国南海热带海洋环境中分离纯化出产琼胶酶菌株FG15,并以16S rDNA进行分子鉴定,分析其酶学性质。FG15为革兰氏阴性球菌,对硫酸链霉素,氨苄青霉素,羧苄青霉素和氯霉素都不敏感。通过16S rDNA序列分析和BLAST同源性比对发现:FG15菌株的16S rDNA序列与船蛆杆菌(Teredinibacter turnerae),噬琼胶菌属(Agarivorans sp.)对应序列同源性最高,为95%。利用MEGA 5.0软件构建系统发育树,FG15与噬琼胶菌属(Agarivorans sp.)亲缘关系最近,同源性高达99%。因此,可以初步鉴定FG15为噬琼胶菌属(Agarivorans sp.)。酶学性质的研究表明:FG15所产琼胶酶的最适温度为36℃,在20~45℃之间热稳定性较好;最适pH为7.5,在pH 7.0~8.0之间酸碱稳定性较好;产酶主要为胞外酶;琼脂酶的动力学参数米氏常数Km为4.978mg/mL,最大反应速率Vmax为10.33μmol/(L·min)。     

琼胶酶生产菌的筛选、鉴定及其酶学性质的初步研究

从青岛近海的红藻(Gelidium amansii)中分离筛选到一株高活力的海洋琼胶降解菌AT-22，生理生化试验鉴定该细菌为假单胞菌(Pseudomonas sp．)。对其生长、产酶特性和酶活力影响因素的研究结果表明：AT-22所产琼胶酶为诱导酶，0．2％葡萄糖的添加对菌株产酶有抑制作用。该酶作用的最适pH为6．0～7．0，最适温度为40℃，最适底物浓度为1．0％～1．2％，Ca^2 离了的添加对酶促反应有较强的促进作用，而Fe^3 、Mn^2 、Cu^2 和Hg^2 等离子有不同程度的抑制作用。     

外切型琼胶酶AgaO的高效表达及酶学性质表征

根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化外切型琼胶酶AgaO的基因并人工全合成,克隆入表达载体质粒pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件即诱导温度、诱导时间和诱导剂IPTG终浓度,纯化重组蛋白rEAgaO,并分析其酶学性质变化。结果表明,重组酶rEAgaO在16 ℃、IPTG终浓度0.1 mmol/L条件下诱导20 h时表达量最高;95%以上的重组蛋白质为水溶性表达,产量约为1432.7 mg/L,较优化前原始基因的产量提高了10.9倍;重组酶rEAgaO的最适反应温度为45 ℃,在低于40 ℃的温度下预处理2 h后,仍然具有90%以上的残余活性,最适pH为7.0,在pH6.0~10.0不同缓冲体系4 ℃处理2 h仍保留69.5%以上的活性;该酶降解琼脂糖后的最终产物经TLC分析鉴定为新琼二糖。基因密码子优化虽不改变蛋白质氨基酸序列,但可明显提高水溶性重组蛋白质的产率及酶活,对促进相关酶类的生产和应用具有借鉴意义。     

乳酸菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性研究

本文采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤方法分离纯化乳酸菌中β-葡萄糖苷酶.经SDS-PAGE测定其相对分子量约为60kD.该酶以对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷为底物时,最适pH值和最适温度分别为6.0和40℃.在45℃以下,pH值在4.5～7.0之间酶活力相对稳定.Hg^2＋和Ag^＋对该酶活力有明显的抑制作用.     

Biochemical Characterization of an Extracellular Heat‐Stable Protease from Serratia liquefaciens Isolated from Raw Milk

The protease Ser2 secreted by the psychrotrophic strain Serratia liquefaciens L53, a highly proteolytic strain isolated from Brazilian raw milk was purified and characterized. Using azocasein as substrate, Ser2 exhibited activity in a wide range of pH (5 to 10) and temperature (4 to 60 °C). The optimal activity was detected at pH 8.0 and at a temperature of 37 °C. This protease, still active at 4, 7, and 10 °C, was strongly inhibited by chelating agents and by dithiothreitol, a reducing agent. These results confirmed that Ser2 belongs to the peptidase family M10 and requires Ca²⁺, Zn²⁺, and disulfide bridges for stability. This protease is able to hydrolyze three kinds of casein in the preferential order of κ→ β→ α‐casein. Highly heat‐stable in skimmed, semi‐skimmed, and whole milk at 140°C with D‐values of 2.8, 3.9, and 4.5 min, respectively, Ser2 showed a residual activity between 87 and 100 percent after heat‐treatment of 65 °C for 30 min, 72 °C for 20 s, and 140 °C for 4 s that are commonly used in dairy industries. As the protease AprX that is mainly secreted by Pseudomonas genus, Ser2 could be one of the main causes of UHT milk destabilization during storage.     

黏质沙雷氏菌胞外几丁质酶的纯化及特性

黏质沙雷氏菌几丁质酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE-琼脂糖凝胶阴离子交换层析和苯基-琼脂糖凝胶疏水层析,得到电泳纯的几丁质酶和几丁质结合蛋白CBP21。该几丁质酶和CBP21分子质量分别约为58 ku和21 ku,CBP21对该几丁质酶水解几丁质增效明显。几丁质酶反应最适温度为50℃,最适pH约为6.5～7.0。该酶在55℃以下、pH 4.5～8.0范围内稳定。酶的Km值为0.22 mg/mL,Vm为1.26μmol/(min.mg)。金属离子K+、Sn2+、Mn2+对酶有一定激活作用,而Pb2+、Hg2+和Cu2+则强烈抑制其活性。该几丁质酶的糖基含量约为3.3%。EDTA和2-ME可分别提高酶活力65%和105%。H2O2强烈抑制酶活力,提示其活性中心可能存在硫氢基。     

Purification and Characterization of Extracellular Isoamylase from Flavobacterium sp

An extracellular isoamylase from Flavobacterium sp., was purified by fractionation with ammonium sulfate, DEAE-cellulose, DEAE-Sephadex A-50, and CM-cellulose column chromatography. Single band of the debranching activity of the purified enzyme was detected by polyacrylamide gel electrophoresis. The enzyme efficiently hydrolyzed α-1,6-glucosidic linkage of glycogen and amylopectin and formed amylose chains, but did not hydrolyze pullulan. The enzyme released maltotriose from ß-limit dextrin of waxy maize amylopectin and glycogen, but no detectable maltose and glucose. Action of the isoamylase is similar to other microbial isoamylases but its physical properties are different.     

巨大芽孢杆菌产胞外核糖核酸酶的分离纯化及部分酶学性质研究

巨大芽孢杆菌发酵液经硫酸铵沉淀、CM-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析,纯化得到核糖核酸酶电泳纯品,并对其性质进行研究。该酶比活力为54272.27U/mg,回收率为11.37%,纯化倍数为606.67倍。该酶分子质量约为33.3kD,最适温度为52.5℃,最适pH值为8.5,在20～40℃以及pH6.0～7.0范围内稳定性较好。Fe2+、Cu2+、SDS、抗坏血酸和草酸对该酶活性有抑制作用。     

深海嗜热菌耐高温Mn-超氧化物歧化酶的性质研究

嗜热菌Bacillus sp.SCSIO 15121是从南中国海沉积物中分离的,本研究从其基因组中克隆了一个编码超氧化物歧化酶的基因SODBa3,该基因长度为609 bp,对应着202个氨基酸残基。本研究构建p ET28a(+)-SODBa3表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了SODBa3的可溶性异源表达。本文研究了重组SODBa3的酶学性质,最适p H为8.0~8.5,最适反应温度为60℃,酶活为3215.6 U/mg。经鉴定,SODBa3对CH3Cl-C2H5OH敏感,但对H2O2不敏感,因此SODBa3是一种Mn离子特异的SOD。采用圆二色谱结合不同温度下酶活的变化研究酶的热稳定性,结果说明SODBa3在40~70℃处理1 h酶活保持较高的稳定性,在100℃下处理1h剩余酶活为50%。金属离子耐受性试验表明5 m M的Mn2+对SODBa3的酶活有促进作用,SODBa3对乙醇和DMSO的耐受性较好,剩余酶活分别为对照的112.56±9.77和98.55±6.47%,这些结果表明SODBa3具有较好的工业应用前景。     

盐渍与水发海参的细菌分离鉴定

从盐渍与水发刺参中分离到10株菌,6株革兰氏阴性菌,4株革兰氏阳性菌。形态及生理生化反应测试结果表明,10株菌分别为3种棒状杆菌(Corynebacterium sp.)、嗜冷杆菌(Psychrobacter phenylpyruvica Bowman)、华氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、栖稻黄色单胞菌(Flavimonas oryzihabitans Holmes)、脲放线杆菌(Actinobacillus ureae Mutters)和少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis Yabuuchi),后5株为致病菌或条件致病菌。检测了10株菌的胞外酶活性,实验结果表明10株菌对酯均无分解能力,9株菌具有胶原蛋白酶活性,7株菌具有淀粉酶活性,6株菌具有酪蛋白酶活性。多种致病菌严重影响了刺参的食用安全,也是刺参易腐败降解的一个重要因素。     

Purification and Characterization of Four Extracellular Proteases Isolated from Raw Milk Psychrotrophs

Extracellular proteases from psychrotrophic strains of Bacillus coagulans (LY 9), Bacillus sp. (LY 10), Bacillus subtilis (LY 11), and Pseudomonas fluorescens (LY 13) were purified and characterized. The molecular weight of the purified protease from Pseudomonas fluorescens LY 13 was 4.50 × 10⁴, and from the three Bacillus species ranged from 3.35 × 10⁴ to 3.90 × 10⁴. The proteases from LY 10 and LY 13 were monomeric proteins, whereas the protease from LY 9 was in a polymeric form that contained up to 14 subunits. Only the protease from Pseudomonas fluorescens LY 13 showed trypsin-like activity. All four proteases were inhibited by ethylenediaminetetraacetate and would be classified as metallo proteases. Casein was the preferred substrate for these proteases. Susceptibility of casein fractions to attack by these proteases varied with the enzyme source. Maximum enzyme activity was between pH 6.5 and 7.5. The protease from Pseudomonas fluorescens LY 13 retained more activity after heating at 63°C for 30 min than the proteases from the three Bacillus species. Calcium ion showed a protective effect by decreasing heat denaturation of the proteases from LY 9 and LY 11. This protective effect tended to be greater in the presence of Tris-HC1 buffer (.05 M, pH 7.5) plus 10% skim milk than in buffer only.