DTP—ELISA试剂盒的试制及应用

本文用 ELISA 法测定了普通人群和免疫前后人血清中白喉、破伤风及百日咳(DTP)抗体水平,并与经典的破伤风抗毒素小鼠中和试验(TNT)、白喉抗毒素家兔皮内中和试验(DNT)及百日咳细菌凝集试验(PA)进行了比较。同时试制出 DTP 血清抗体定性和定量检测药盒。结果表明,在人血清抗体测定中 ELISA 与 TNT、DNT 及 PA 的符合率分别为91.5%、97.9%和91.5%,三者间有良好一致性。20份免疫马血清破伤风抗毒素测定表明 ELISA 与 TNT 相关良好(r=0.84,P<0.01)。以国际上公认的免疫保护水平(TAT≥0.01IU/ml、DAT≥0.01IU/ml 和 PA≥1∶320)为标准,换算成 ELISAP/N 比值(≥2.1)作为试剂盒判断标准,测定了100份普通人群和81例 DTP 接种前后小儿血清,结果100份普通人群血清中含的抗白喉、破伤风及百日咳抗体者分别为28%、38%和45%;接种后小儿血清阳性率分别为88.9%、(白喉)、90.1%(破伤风)和81.5%(百日咳)。ELISA 法具有良好重复性和敏感性,简便经济,可作为临床和流行病学调查及菌苗效果监测的有效工具。     

破伤风抗体IgG酶联检测试剂盒的研制

目的 研制检测破伤风IgG的酶联检测试剂盒。方法 以精制破伤风类毒素进一步纯化后作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人IgG作为抗体制备ELISA试剂盒,并进行敏感性、特异性及重复性检测。结果 试剂盒敏感性可达0.003 9 IU/ml,特异性达95％以上,重复性好,CV<7％,试剂盒置于37℃、7 d敏感性无明显改变。结论 成功地制备了破伤风抗体IgG酶联检测试剂盒。     

破伤风抗体体外结合ELISA检测方法的建立及初步验证

目的建立破伤风抗体体外结合ELISA检测方法,并进行初步验证。方法将破伤风疫苗免疫后获得的小鼠血清与破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)在体外进行结合,将结合后的血清转移至已包被的酶标板中,分别加入二抗、酶标抗体和底物等进行检测,建立破伤风抗体体外结合双抗夹心ELISA法。对建立的方法进行特异性、线性范围、检测限、重复性和准确性初步验证。结果建立的破伤风抗体体外结合双抗夹心ELISA法的标准曲线在浓度为0.016~1 U/ml之间时,可获得最佳线性,相关系数R=0.999 8;检测限为0.009 U/ml;与白喉-百日咳抗体无交叉反应;重复性验证中高浓度和低浓度质控血清的变异系数(CV)分别为4.467%和5.419%;准确性验证中高浓度和低浓度质控血清的相对偏差分别为-8.03%和-14%。结论建立的破伤风抗体体外结合ELISA检测方法具有良好的特异性、重复性和准确性,为破伤风疫苗效价检测新方法的建立奠定了基础。     

A群奈瑟脑膜炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物的制备及其工艺稳定性

目的按初步确定的工艺,制备A群奈瑟脑膜炎球菌荚膜多糖(Group A Neisseria meningococcus capsular polysac charide,GAMP)与破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)的结合物,通过监测关键工艺参数,分析该工艺的稳定性。方法制备8批GAMP-TT结合物,经Sepharose4FF柱层析纯化后,进行各项生化鉴定,采用双向免疫扩散试验检测其抗原性,以结合物皮下免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清中抗GAMP及抗TT IgG抗体水平。结果制备的8批结合物工艺关键参数较稳定,均保持GAMP抗原特异性;免疫小鼠后,均可诱生较高水平的血清抗GAMP IgG抗体,并可诱生免疫加强应答。结论该制备工艺稳定,为GAMP-TT结合疫苗的研制提供了参考。     

胶体金法检测血清Hp-IgG抗体的应用价值

目的比较胶体金法检测血清Hp-IgG抗体与酶联免疫吸附试验(ELISA)法、尿素酶法检测血清Hp-IgG抗体结果之间的差异。与诊断标准进行对比,评价胶体金法检测Hp-IgG抗体的可行性。方法对36例尿素酶试验阳性和26例尿素酶试验阴性患者做ELISA、胶体金法检测血清Hp-IgG抗体。结果对比3种方法结果无显著差异(P>0.05)。结论胶体金法检测Hp-IgG抗体灵敏度高,特异性强,快速方便,对人体刺激性小,不需特殊的仪器设备,是较为理想的幽门螺杆菌(Hp)感染者的筛查实验。     

狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立及初步应用

目的建立狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,用于不同株狂犬病疫苗免疫后抗体水平的检测。方法用市售的不同狂犬病疫苗株抗原免疫NIH小鼠,制备免疫血清,用不同的疫苗株抗原包被酶标板,分别测定小鼠血清抗体效价,并通过不同株抗原抗体的交叉中和实验,分析抗原的差异性;在此基础上,将不同毒株抗原按不同比例混合包被酶标板,分别测定阳性血清样本,并与快速免疫荧光抑制试验(RFFIT)检测结果比较,确定包被抗原模式,建立狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,绘制标准曲线,确定最佳定量范围及灵敏度,确定Cut-off值;并对其特异性、精密性、准确性及稳定性进行验证;用建立的方法与其他市售狂犬病病毒抗体检测试剂分别检测血清样品,分析检测结果的一致性及相关性。结果狂犬病病毒抗原AG∶CTN-1=4∶1为最适包被抗原模式,试剂经优化后,检测抗体效价范围在535.00～33.44 mIU/ml之间,具有良好的线性关系(r>0.99),最低检出限为8.36 mIU/ml,Cut-off值为0.735 mIU。该方法检测人血清白蛋白、破伤风阳性血清、乙肝表面抗原阳性血清、白喉阳性质控血清均未发生反应;试验内变异系数在6.68%～7.84%之间;回收率在97.25%～104.50%之间;试剂置37℃3 d,与4℃保存试剂测定结果差异无统计学意义(P>0.05)。该方法检测血清样品与市售狂犬病病毒抗体检测试剂比较,均具有良好的一致性;与RFFIT测定结果比较,二者差异无统计学意义(P>0.05),回归方程为Y=-0.475+3.246 X,相关系数为0.801。结论已建立了狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,可用于大规模狂犬病病毒抗体的筛查。     

肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗两种免疫途径对小鼠抗体应答的比较

目的比较肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗两种免疫途径对小鼠的抗体应答。方法选NIH小鼠,分别经皮下和腹腔途径免疫3次同等剂量的结合疫苗,每次间隔2周,用ELISA方法检测两种途径免疫小鼠的血清抗体滴度。结果结合疫苗经腹腔免疫后的抗体滴度优于皮下免疫。小鼠经腹腔免疫3次后,血清抗体的几何平均滴度分别是第1次免疫的6·6倍和3·5倍。结论结合疫苗经腹腔免疫较皮下免疫获得的抗体应答水平高。     

胶体金法试剂与EIA试剂检测梅毒螺旋体抗体的临床比较分析

目的探讨胶体金法梅毒螺旋体(TP)抗体试剂的灵敏度与特异性。方法用胶体金法与EIA法对188份梅毒患者血清样本进行检测。结果TP抗体S/CO值在>10.0时,胶体金法与EIA法的阳性符合率只有85.3%。结论胶体金法检测TP抗体S/CO值高值样本时存在着一定的漏检率。     

3种不同方法检测梅毒的结果比较分析

目的 探讨与分析3种不同方法检测梅毒的临床价值。方法 对我院98例梅毒患者与50例健康体检者均分别采用甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)、螺旋体明胶颗粒凝集试验(TPPA)、梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒(胶体金法)检测血清梅毒,对3组检测方法的结果进行比较分析。结果 TRUST的试验检验符合率为86.7%,TPPA的试验检验符合率为100%,胶体金的试验检验符合率为99.0%。TPPA与TRUST相比(χ2=13.92,P<0.01)有统计学差异。胶体金与TRUST相比(χ2=11.08,P<0.01)有统计学差异。结论 胶体金法的检出率明显优于TRUST,但与TPPA相比则无明显差异,故胶体金法在对梅毒的检测中比TRUST的准确率高,比TPPA更易操作,且成本较低。     

小鼠血清乙型肝炎病毒前S2抗体间接ELISA检测方法的建立

目的建立小鼠血清乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)前S2抗体间接ELISA检测方法。方法以HBV前S2(1～26)多肽包被酶标板,利用方阵滴定法确定间接ELISA法的最适工作条件,验证该方法的精密度、灵敏度和特异性,并与商品化试剂盒进行比较。结果确定最佳抗原包被浓度为2μg/ml;血清稀释度为1︰10,37℃反应30 min;HRP标记的羊抗小鼠IgG最佳稀释度为1︰10 000,37℃反应30 min;TMB底物37℃显色15 min,以2.1×阴性对照血清A450均值(阴性对照血清小于0.05时按0.05计算)为Cut-off值。该方法具有良好的试验内和试验间精密度;与商品化试剂盒比较,灵敏度为100%,特异性为97.3%,二者符合率为98.5%。结论已成功建立HBV前S2抗体间接ELISA方法,可用于小鼠血清中前S2抗体的检测。     

Fabrication of a novel electrochemical immunosensor based on the gold nanoparticles/colloidal carbon nanosphere hybrid material

The gold nanoparticles/colloidal carbon sphere hybrid material was used for the immobilization of protein, and was developed in biosensing. The hybrid material was fabricated by the assembly of gold nanoparticles onto the surface of colloidal carbon spheres, which constructed a 3D antibody immobilization matrix on the glass carbon electrode and made the immobilized biomolecules hold high stability and bioactivity. After the sandwich-type immunoreaction, the formed HRP-labeled immunoconjugate showed good enzymatic activity for the oxidation of o-phenylenediamine by H₂O₂. The approach provided a linear response range between 5 and 250 ng/mL with a detection limit of 1.8 ng/mL. The immunosensor showed good precision, acceptable stability and reproducibility and could be used for the detection of human IgG in real samples, which provided a potential alternative tool for the detection of protein in clinical laboratory.     

氰戊菊酯残留胶体金免疫层析试纸条研制

应用胶体金免疫层析技术研制出一种准确、快速、简便检测氰戊菊酯农药残留的试纸条.采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,标记氰戊菊酯单克隆抗体,以硝酸纤维素膜为载体,包被氰戊菊酯抗原作为检测线(T线),包被兔抗鼠IgG抗体作为质控线(C线),经过竞争反应后目测结果.实验结果表明,该快速检测试纸条100%抑制浓度为800 ng/m...     

应用免疫策略对蒙脱石HIV DNA疫苗免疫作用的研究

目的运用Prime—Boost策略,研究蒙脱石(MMT)DAN疫苗对小鼠免疫功能的影响。方法选用3H-TdR掺入法测定MMT和DNA联合免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖反应;采用ELISA试剂盒检测血清中的抗体和细胞因子。结果使用痘苗病毒和/或加入MMT加强免疫DNA疫苗后,均可以提高其体液和细胞免疫功能。结论“Prime-boost-boost”免疫方案在小动物模型中取得了较好的免疫效果。     

大肠杆菌表达的破伤风毒素C片段的免疫原性分析

目的　分析大肠杆菌表达的破伤风毒素C片段 (简称TTC)的免疫原性。方法　利用分子生物学技术在大肠杆菌中表达破伤风毒素C片段 ,用阴离子交换层析和金属离子螯合亲和层析方法进行蛋白纯化。参照2 0 0 0年版《中国生物制品规程》的方法检测表达产物的效价。用间接血凝实验检测免疫动物血清中的破伤风抗体单位。结果　重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的 15 %。纯化后蛋白纯度达到 96 5 %。免疫效价为 18 70 6IU mg ,ED50 为 2 0 μg。 1μgTTC经 4次免疫能诱导机体产生足够的抗体 ,保护动物免受破伤风毒素的攻击。 结论　重组蛋白具有良好的免疫原性 ,为开发基因工程疫苗奠定了基础     

疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法的建立

目的建立疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法。方法制备Vero细胞蛋白抗原参考品,免疫家兔,提纯抗体作为包被抗体并以酶标记,建立酶联免疫检测系统。用Vero细胞蛋白抗原参考品绘制定量标准曲线,并对各项指标进行验证。结果提纯后抗体纯度达90%以上,抗体效价为1∶64,Westernblot分析显示,提纯抗体与Vero细胞蛋白抗原参考品中绝大部分蛋白成分均能特异性结合。确定最佳抗体包被浓度为10μg/ml,酶标抗体的工作浓度为1∶1000。Vero细胞蛋白抗原参考品定量范围为12.5～800.0ng/ml时,线性关系良好,r=0.997,该方法特异性、精密度及准确度良好。将试剂于4、25和37℃分别放置3周,检测同一定量参考品和样品中Vero细胞蛋白抗原含量,差异无显著意义。结论已建立了用ELISA检测疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量的方法。     

胶体金技术测定黄瓜中甲霜灵残留

比较了胶体金试纸法与气相色谱法在检测黄瓜甲霜灵残留中的应用。结果表明,胶体金试纸检测为阴性的样品,经气相色谱检测结果为未检出,阳性样品经气相色谱检测结果与胶体金试纸相一致。与气相色谱法比较,胶体金试纸法检测甲霜灵具有操作简便、直观、快速、省时的特点,其特异性、较高的敏感性,可作为黄瓜中甲霜灵残留现场检测的手段应用。     

抗霍乱弧菌O1群单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗霍乱弧菌O1群特异性单克隆抗体(McAb),并进行鉴定。方法以福尔马林灭活的O1群霍乱弧菌免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术建立分泌抗O1群霍乱弧菌McAb的杂交瘤细胞株。对配对较好的6个细胞株分泌的McAb进行腹水效价、免疫球蛋白类及亚类、抗体亲和常数测定及凝集试验和稳定性试验。与细菌培养法对比检测208份临床标本。结果6个细胞株分泌的McAb腹水效价均为105,均为IgM;抗体亲和常数为1.84×105～5.38×107;且均与O1群霍乱弧菌菌株发生凝集反应,与霍乱弧菌O139群、大肠杆菌、出血性大肠杆菌O157∶H7、副溶血弧菌、麦弧菌、河弧菌、结肠炎耶尔森菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及各型副伤寒杆菌均不发生凝集反应。6个分泌McAb的细胞株连续培养15周,经液氮冻存12个月后复苏,仍能稳定分泌抗体;与细菌培养法对比检测208份临床标本,特异性和灵敏度均达100%。结论制备的McAb具有较高的特异性,有可能用于开发霍乱弧菌O1群的检测试剂。     

胶体金免疫层析法快速检测水果中三氯杀螨醇残留

[目的]建立了快速检测水果中三氯杀螨醇残留的胶体金免疫层析方法.[方法]在对固相载体进行优化的基础上,基于竞争抑制模式建立胶体金免疫层析方法.[结果]该方法对水果中三氯杀螨醇的检出限为1.0 mg/kg,满足国家标准对水果中三氯杀螨醇最大残留限量的要求,且特异性良好.[结论]该方法具有快速、简便、经济实用等特点,适用于...