新城疫病毒F基因与传染性法氏囊病毒VP0基因在鸡痘病毒中共表达

目的 新城疫病毒（NDV）F基因和传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP0基因在鸡痘病毒中表达,以便研制新城疫和传染性法氏囊多价重组疫苗。方法 利用鸡痘病毒282E4株非必需区TK基因构建的表达载体PU-TA2,在已存在的复合启动子p7.5ATI下游同向插入F基因,反向插入复合启动子P7.5ATI,并在其下游反向插入VP0基因,构建由2个相同的复合启动子在相反方向分别表达F和VP0蛋白的PATI2-F-VP0表达载体。使其与鸡痘病毒282E4株共转染CEF细胞后,用BUDR法筛选重组病毒,通过间接免疫荧光法检测阳性重组病毒。用Western blot法检测F和VP0蛋白。结果 在重组病毒株中,用Western blot法可检测到F和VP0蛋白。结论 已成功地获得可同时表达F蛋白和VP0蛋白的重组鸡痘病毒。     

鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的原核表达与抗原性分析

目的表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)弱毒株VP2蛋白并检测其抗原活性。方法以IBDV强毒致弱株Gt株基因组RNA为模板,应用RT-PCR方法扩增VP2基因,并将其克隆入pUC18载体,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将其亚克隆到原核表达载体pET30a中,并经酶切、PCR、测序鉴定,阳性重组表达质粒转化E.coliBL21(DE3)菌,经IPTG诱导后,表达产物用SDS-PAGE及Westernblot检测。结果阳性重组表达质粒转化E.coliBL21(DE3)后,经诱导表达了目的蛋白,表达量占菌体总蛋白的15%。Westernblot检测表达蛋白可与IBDV阳性血清发生反应,而与阴性对照血清不发生反应。结论已成功表达了鸡传染性法氏囊病毒弱毒株VP2蛋白,且具有良好的抗原性。     

HIV-2 Gp105基因重组鸡痘病毒的构建及鉴定

目的　研制预防HIV -2的重组鸡痘病毒活载体疫苗。方法　将HIV -2Gp10 5基因插入鸡痘病毒转移载体pUTA2复合启动子的下游 ,构建鸡痘病毒转移载体pUTA2 Gp10 5。将该重组质粒与鸡痘病毒 (FPV) 2 82E4株共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,进行同源重组。通过 3次BrdU加压筛选 ,以PCR、RT PCR、IFA和Westernblot鉴定重组病毒。结果　从重组鸡痘病毒的基因组和总RNA中能扩增出大小为 6 5 3bp的目的基因 ;感染重组病毒的CEF细胞与特异性荧光抗体发生阳性反应 ;表达产物与人HIV- 2血清发生阳性反应 ,目的蛋白相对分子质量约为10 5 0 0 0。结论　成功获得 1株重组鸡痘病毒 ,可正确表达HIV 2Gp10 5基因。     

表达PRRSV GP5、GP3和猪IL-18的重组鸡痘病毒的构建及鉴定

目的研制安全有效的预防猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组鸡痘病毒活载体疫苗。方法将PRRSV长春株的GP5和GP3基因插入到含有猪IL-18基因的鸡痘病毒转移载体pUTAL复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移载体pUTAL-IL-18-GP5-GP3。将该重组质粒与鸡痘病毒(FPV)282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。通过3次BrdU加压筛选,经PCR、RT-PCR和IFA方法鉴定重组病毒。结果从重组鸡痘病毒基因组和总RNA中扩增出340bp的目的基因片段,感染重组病毒的CEF细胞与特异性荧光抗体发生阳性反应,表明目的基因在重组鸡痘病毒中得到表达。结论已成功构建1株重组鸡痘病毒,并可正确表达PRRSVORF5/ORF3基因。     

人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1基因重组MVA病毒的构建及鉴定

目的研制预防人乳头瘤病毒(HPV)感染的重组修饰的Ankara痘病毒(MVA)活载体疫苗。方法将HPV16L1基因插入MVA病毒转移载体psc11M2的P7·5启动子的下游,构建转移质粒psc11M2-L1,与MVA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。通过9轮蓝斑筛选,以PCR和Westernblot鉴定重组病毒。结果获得的含目的片段的重组MVA病毒,表达产物与鼠抗人HPV16L1抗体发生阳性反应,目的蛋白相对分子质量约为55000。结论已成功地构建了可正确表达HPV16L1基因的重组MVA病毒株。     

口蹄疫病毒VP1、VP4基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)VP1、VP4基因核酸疫苗质粒,并研究其免疫原性。方法通过RT-PCR获得FMDVVP1、VP4基因,以真核表达载体pIRESneo为基础,构建VP1单表达以及VP1、VP4融合表达和共表达质粒。转染BHK-21细胞后,Western blot检测目的蛋白的表达。将上述3种基因核酸疫苗、VP1单表达与VP4单表达联合疫苗、灭活疫苗和空载体对照免疫豚鼠,检测血清特异性抗体及中和抗体水平,并进行保护力试验。结果VP1单表达,VP1、VP4融合表达及共表达质粒经PCR及酶切鉴定,证明构建正确。各组核酸疫苗质粒均能诱导产生中和抗体,且具有一定的保护效力。VP1单表达组和联合组保护率均为28.6%;共表达组和融合表达组保护率均为42.9%;灭活疫苗组保护率为100%;空载体组保护率为0。结论口蹄疫病毒VP1与VP4共存时能发挥更好的免疫原性。     

重组口蹄疫鸡痘病毒vUTAL3CP1的构建及其遗传稳定性和免疫原性

目的构建重组口蹄疫鸡痘病毒,并检测其遗传稳定性和免疫原性。方法将口蹄疫病毒(FMDV)的衣壳蛋白前体P1-2A和蛋白酶3C基因插入到鸡痘病毒表达载体中,构建重组鸡痘病毒转移载体pUTAL3CP1,并与鸡痘病毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU加压筛选获得重组鸡痘病毒vUTAL3CP1。重组病毒在CEF中连续传30代,分别进行毒力和基因检测,并免疫BALB/c小鼠,检测特异性抗体和中和抗体。结果重组鸡痘病毒经RT-PCR可扩增出目的基因;特异性荧光抗体反应呈阳性;在CEF中连续传30代,毒力稳定,基因未发生缺失和变异;免疫小鼠能产生较高水平的FMDV特异性抗体和中和抗体。结论已成功构建重组口蹄疫鸡痘病毒,且具有良好的遗传稳定性和免疫原性。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的串联与原核表达

目的构建C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,并鉴定其表达产物的免疫反应性。方法首先合成C型口蹄疫病毒C-S8C1株VP1基因的3个抗原表位,并克隆到pMD18-T载体上,再按设计的酶切位点酶切后连接,构建出C型VP1双拷贝基因片段(VP1C)。将VP1C基因连接到原核表达载体pET-CKS上,构建重组质粒pETCKS-VP1C,转入BL21菌中进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物,并利用包涵体洗涤法对表达产物进行初步纯化。结果VP1C基因在大肠杆菌中获得表达,产量占沉淀蛋白的45%,且表达产物可以被C型口蹄疫病毒标准血清所识别。VP1C重组蛋白纯度达84.1%。结论已成功构建了C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,所表达的VP1C有良好的免疫反应性,可以作为检测C型口蹄疫病毒的候选基因。     

表达猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因重组鸡痘病毒的构建与鉴定

目的构建表达猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组鸡痘病毒。方法将PCV2ORF2基因插入到转移载体pUTAL复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTA-ORF2,将该质粒与鸡痘病毒野生株282-E4共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。经BrdU加压筛选重组鸡痘病毒,采用RT-PCR和间接免疫荧光法进行鉴定。结果重组鸡痘病毒感染的CEF经RT-PCR可扩增出260bp的目的基因,间接免疫荧光检测可见特异性黄绿色荧光,表明目的基因在重组鸡痘病毒中得到表达。结论已成功构建了1株表达PCV2ORF2基因的重组鸡痘病毒。     

脑心肌炎病毒GS01株VP1基因表达载体的构建及酵母表达

目的构建脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)GS01株衣壳蛋白VP1的真核表达载体,并利用酵母真核表达系统获得具有抗原性的分泌性VP1成熟多肽。方法扩增EMCV GS01株VP1基因,与酵母表达载体pPIC9K重组,构建表达质粒p PIC9K-VP1;用醋酸锂转化法转化酵母菌GS115,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子;阳性克隆经甲醇诱导表达后,利用SDS-PAGE及Western blot鉴定培养上清中VP1蛋白的表达情况及抗原性。结果重组质粒pPIC9K-VP1经酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的VP1蛋白相对分子质量约34 000,为分泌性表达,能被兔抗EMCV盐析血清特异性识别,具有天然VP1蛋白的反应原性。结论实现了EMCV GS01株VP1蛋白的酵母真核表达,为在体外研究VP1与宿主细胞的相互作用机制及EMCV基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

猪轮状病毒Gottfried株和SB-1A株截短VP8基因的原核表达、蛋白纯化及免疫原性分析

目的原核表达猪轮状病毒(porcine rotavirus,PRV)Gottfried株和SB-1A株截短的VP8*基因,纯化重组蛋白,并检测其免疫原性。方法经PCR从含有全长VP4基因片段的重组质粒pCR4-Gottfried VP4和pCR4-SB-1A VP4中分别扩增截短的VP8*基因(△VP8*,64～223位氨基酸),分别插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-Gottfried-△VP8*和pET-28a-SB-1A-△VP8*,分别转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。应用ProBondTMResin纯化两种重组蛋白,重组蛋白与A(lOH)3佐剂混合后,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平。结果两种重组表达质粒经双酶切和测序证实构建正确;表达的两种目的蛋白相对分子质量约25 000,均以包涵体和可溶性两种形式存在,均可与鼠源抗Histag单克隆抗体特异性结合;纯化的两种重组蛋白纯度均在95%以上,免疫BALB/c小鼠可产生较高的血清抗体水平。结论成功在大肠埃希菌中表达了PRV Gottfried株和SB-1A株截短的VP8*基因,纯化的两种蛋白免疫原性较好,为进一步研制安全、高效的PRV亚单位疫苗奠定了基础。     

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group A type 16,CA16)VP1蛋白,并检测其免疫原性。方法通过RT-PCR法从CA16病毒青岛株中扩增VP1基因,克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET43.1a-VP1,转化感受态E.coli Rossatte(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组CA16 VP1蛋白通过Ni柱亲和层析纯化后,采用不同剂量(5、10、20、40μg)免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价,微量细胞病变抑制法检测血清中和抗体效价。结果重组表达质粒pET43.1a-VP1经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组CA16 VP1蛋白相对分子质量约为34 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15%;纯化的重组CA16 VP1蛋白纯度可达95%以上,可与猴CA16抗血清反应;不同剂量的重组CA16 VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导产生CA16特异性抗体,血清中总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价均明显高于对照组,且抗体效价与免疫剂量存在一定的量效关系;各剂量CA16 VP1组免疫小鼠血清中和抗体效价均小于1∶8。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CA16 VP1蛋白,纯化的重组蛋白可诱导小鼠特异性体液免疫应答,为进一步研究CA16的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础。     

靶向肠道病毒71型VP1基因的siRNA表达质粒的构建

目的构建靶向肠道病毒71型(EV71)VP1基因的siRNA表达质粒,并进行鉴定。方法构建靶向EV71VP1基因的siRNA表达质粒pSVSi1、pSVSi2和pSVSi3;脂质体法转染A549细胞株,筛选阳性克隆,通过荧光定量PCR和Western blot,分别在mRNA水平和蛋白水平鉴定EV71VP1基因的表达。结果质粒pSVSi1、pSVSi2和pSVSi3经测序证明构建正确。pSVSi1对A549细胞VP1基因的抑制效果最好,在mRNA和蛋白水平上的抑制率分别为87%和89%,pSVSi2和pSVSi3在mR-NA水平上的抑制率分别为60%和70%。结论已成功构建了靶向EV71VP1基因的siRNA表达质粒,并筛选出一种对VP1基因有显著抑制作用的siRNA,为手足口病的siRNA基因治疗奠定了基础。     

鹅细小病毒VP3蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)VP3蛋白。方法将GPV VP3基因重组表达质粒pGEX-6P-VP3转化入大肠杆菌BL21(DE3)plysS内,IPTG诱导表达;用Sepharose 4B(Prepacked Glutathion)亲合层析柱纯化可溶性和不溶性包涵体蛋白,并进行SDS-PAGE、Western blot及Dot-ELISA鉴定。结果表达的GST/VP3融合蛋白相对分子质量为85 000,主要以不溶性包涵体形式存在;纯化的可溶性蛋白和包涵体蛋白含量分别为2.20和3.30 mg/ml;纯化的GST/VP3融合蛋白能被鹅抗GPV多克隆抗体特异性识别。结论原核表达并纯化了GPV VP3蛋白,为进一步研究其功能和免疫学特性及研制基因工程亚单位疫苗和新型抗原制剂奠定了基础。