检测食品中大肠杆菌O157的多重荧光PCR方法的建立

针对大肠杆菌O157的志贺毒素编码基因stx1、stx2和O157血清型的标志基因wzy的保守序列,设计特异性的引物和探针,反复优化反应体系和条件,建立了一种新的多重荧光PCR检验方法.结果显示,该方法灵敏度高,stx1、stx2的扩增效率分别为96.4%和94.6%,实际样品检测时stx1、six2的最低检出限分别为4.2×102cfu/mL和4.2×103cfu/mL.该方法特异性强,扩增结果与各参考菌株基因型一致,能良好的区分出O157菌株和非O157犁大肠杆菌.该方法能用于食品样品的检测和流行病学分离株的快速鉴定.     

大肠杆菌O157的志贺毒素基因克隆和测序

将一株大肠杆菌O157PCR扩增stx2基因全长并克隆测序。该菌株stx2基因与GenBank数据库收录的stx2基因最高同源性为98%,在3个核苷酸位点存在基因突变。采用邻位相连法构建进化树,序列分析结果表明O157为stx2C基因亚型。了解大肠杆菌O157的基因突变情况,并为开发大肠杆菌分子检测方法提供了参考。     

PCR 法检测食品中大肠杆菌O157:H7

对大肠杆菌O157:H7 型菌株的各毒力基因及基因组中的特异序列进行了设计和比对,确定292bp 的检测引物。常规定性PCR 和实时定量PCR 证明该引物特异性强。模拟样品的前增菌实验结果表明本方法可以在原样品活菌浓度约2.0CFU/mL 时通过16h 增菌后检测出来,总的检测时间可以控制在24h 内。本实验建立的PCR 方法可用于食品中大肠杆菌O157:H7 的快速测定。     

大肠杆菌O157:H7的免疫捕获PCR快速检测

研究用特异性的出血性大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被处理的PCR管,对样品中的病原菌进行特异性免疫富集,以免疫捕获-PCR(Immunocaptured PCR,IC-PCR)管中捕获到的病原菌作为模板进行PCR扩增。结果显示免疫捕获-PCR对病原菌出血性大肠杆菌O157:H7检测灵敏度达到102CFU/mL,比直接PCR和ELISA提高了103倍;特异性验证实验证实,对其他10株食源性致病菌进行检测均无目标条带。该方法将免疫学和分子生物学检测结合起来,灵敏度高,特异性强,检测周期短,检测迅速,是适合检测一线进行快速检测的新方法。     

大肠杆菌O157:H7特异基因的实时荧光定量PCR检测

为建立快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chainreaction,RT-PCR)方法,针对大肠杆菌O157:H7的特异基因rfbE设计一对特异引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行灵敏度、重复性和特异性实验,同时与常规PCR方法进行比较。结果显示所建立的SYBRGreenⅠ实时定量PCR方法可以快速、特异地检测出大肠杆菌O157:H7,细菌纯培养物中其灵敏度可达2×101CFU/mL,临床模拟污染肉样中能最低能检测到1×102CFU/mL的大肠杆菌O157:H7。与常规PCR方法相比,SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法对临床样品中大肠杆菌O157:H7的检出率大大提高。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术能快速准确、特异、敏感地检测大肠杆菌O157:H7。     

食品中大肠杆菌O157:H7的两种检测方法研究

研究食品中大肠杆菌O157∶H7的两种检测方法,PCR法引物针对特异性粘附毒素基因(eaeA)扩增检测,双抗夹心ELISA采用鸡抗O157∶H7特异性脂多糖(LPS)抗体(IgY)检测,结果显示两种方法对纯培养物的检测灵敏度都在103～104cfu/mL之间,特异性能满足食品检测需求;PCR法的敏感度较ELISA法高,且较省时。经以牛奶为参考的食品模拟样品(37℃增菌14h)验证两种检测方法的最低检出限均为2.5cfu/25mL样品。      

食品中大肠杆菌O157:H7的两种检测方法研究

研究食品中大肠杆菌O157∶H7的两种检测方法,PCR法引物针对特异性粘附毒素基因(eaeA)扩增检测,双抗夹心ELISA采用鸡抗O157∶H7特异性脂多糖(LPS)抗体(IgY)检测,结果显示两种方法对纯培养物的检测灵敏度都在103～104cfu/mL之间,特异性能满足食品检测需求;PCR法的敏感度较ELISA法高,且较省时。经以牛奶为参考的食品模拟样品(37℃增菌14h)验证两种检测方法的最低检出限均为2.5cfu/25mL样品。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7的分子生物学检测及PCR检测

大肠杆菌一些特殊的血清型具有致病性,肠出血性大肠杆菌是大肠杆菌的一个亚型,主要致病菌株为O157:H7,可引起感染性腹泻,因能引起人类的出血性肠炎而得名。本文综述了分子生物学检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的研究进展。分子生物学检测是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质的分析方法,主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体免疫金层析法以及免疫磁珠分离法(IMS)。PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7,主要包括常规PCR检测、多重PCR检测以及实时荧光定量PCR检测。这两种方法灵敏度高、特异性强、操作简便、结果准确等优点,是检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的常用方法。     

莆田市O157大肠杆菌的调查分析

O157大肠杆菌在美国、日本等发达国家多次暴发流行后,引起全球广泛重视。我们于1997年起采集莆田市城厢区健康畜、禽与腹泻患粪便进行检测,先后检出3种类型的O157大肠杆菌。现报道如下。     

实时荧光单引物等温扩增(SPIA)技术检测大肠杆菌O157的方法研究

建立一种快速、灵敏的食品中肠出血性大肠杆菌O157的检测方法。以大肠杆菌O157的特异性基因(rfbE)为靶序列,设计相应的RNA/DNA组合引物和链终止序列,优化引物浓度、Mg2+浓度、温度等反应条件,建立实时荧光单引物等温扩增(Real Time Fluorescence Single Primer Isothermal Amplification,实时荧光SPIA)检测大肠杆菌O157的方法,并对该方法的特异性、灵敏度以及人工污染检出限进行检测。确定了实时荧光SPIA法的最适反应条件,该方法可以在55 min内完成检测工作,除大肠杆菌O157外,其他细菌均未产生特异性荧光扩增曲线,而且实时荧光SPIA检测大肠杆菌O157的灵敏度为2.0 CFU/m L,对猪肉人工污染样品中大肠杆菌O157的检出限是4.0 CFU/g。实时荧光SPIA方法检测大肠杆菌O157具有耗时短,灵敏度高,特异性强,方法简便的优越性,为检测食源性致病菌构建了一个技术平台。     

Detection of Escherichia coli O157 in bovine meat products in northern Italy

Tests for Escherichia coli and E. coli O157 were carried out on meat samples collected from randomly chosen stores throughout the city of Bologna and suburban areas. The samples consisted of 25 g of loose minced beef, sometimes already shaped into meatballs or hamburgers, some of which were mixed with vegetables. The meat was purchased from retail outlets, open market stalls, and supermarket chains during 25 sampling visits from October 2000 to December 2001. For E. coli detection, Tryptone soya broth (TSB) supplemented with novobiocin and C-EC agar were used. Immunomagnetic separation with SMAC-BCIG-CT agar and chromogenic E. coli O 157 agar, API 20E system and agglutination latex test were used to detect E. coli O157; Vero cell assay and polymerase chain reaction (PCR) were used to assess toxin production and the presence of virulence genes.

E. coli were detected in 45 (30.2%) of the 149 samples examined, mainly in the hamburger samples mixed with vegetables and in the loose minced beef. E. coli O157 was found in one sample of hamburger and two samples of hamburger mixed with vegetables (2%) collected from three different butcher's stores between July and October. All the strains of E. coli O157 and most cases of E. coli were found in meat from small retailers.

The three strains of E. coli O157 were positive for verocytotoxin production. PCR analysis revealed genes coding for vt2 and one strain possessed the gene for eae A. Chromogenic E. coli O157 agar was found to be more selective and differential, allowing easier identification of suspected colonies with mixed flora and producing less false-positive colonies.     

蔬菜中大肠杆菌O157的分离与鉴定

对武汉市售蔬菜(50份)进行大肠杆菌O157的检验,经过新生霉素-EC增菌液增菌、免疫磁珠富集、选择性平板培养和血清学鉴定,从一份生菜中筛出1株O157阳性菌株EC9.23。PCR鉴定该菌毒力基因,stx1、stx2、rfbO157基因均为阳性,hly、eae、fliCH7基因均为阴性。说明从武汉市售蔬菜中可检出携带志贺毒素基因的O157菌株。     

LAMP实时浊度法快速检测肠出血性大肠杆菌O157的研究

采用环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)技术,利用实时浊度仪实时检测LAMP反应过程中所产生的焦磷酸镁白色沉淀,实现对扩增反应全过程的监控,建立食品中肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157的LAMP实时浊度法快速检测方法。针对EHEC O157抗原基因rfbE的序列设计4条特异性LAMP引物。通过实时浊度仪在恒温63℃下1小时完成检测,对方法的特异性、灵敏度、稳定性进行了评价,并进行了食品样品添加试验以评价其应用于实际样品的效果。结果显示,经优化后,该方法的最低检出限为2.8×103 CFU/mL,与PCR法灵敏度比较高100倍。样品添加试验能检出的最低添加菌量为2.8×102 CFU/25 g(或mL)。LAMP实时浊度法具有快速、灵敏、特异性高、操作简便的优势,为食源致病菌快速筛查提供了一种良好的检测模式。     

环介导等温核酸扩增技术快速检测食物中的大肠杆菌O157

建立了环介导等温核酸扩增技术(LAMP)检测食源大肠杆菌O157,并对该方法的灵敏度和特异性进行了评价。分别针对大肠杆菌O157三个特异基因rfbE,stx1和stx2的8个独立靶区域设计了外引物、内引物和环引物进行LAMP扩增检测,同时将检测结果与PCR方法做比较。研究结果表明,rfbE,stx1和stx2基因的LAMP方法检测限分别为100,100和10 fg DNA/管,灵敏度是PCR方法的10倍以上;将建立的环介导等温扩增法用于417株食物分离的大肠杆菌的检测,发现LAMP检测rfbE,stx1和stx2基因的灵敏度分别为100%,95.3%和96.3%,对3个靶基因的阴性预测率分别为100%,96.7%和97.1%,特异性和阳性预测率均为100%。结果表明,该方法用于大肠杆菌O157的检测具有特异性强、灵敏度高、操作简便的优越性,在食品安全检测方面具有良好的实际应用前景。     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7基因组和质粒pO157致病因子

为推动O15 7:H7致病机制的深入研究 ,介绍了近年来对EHECO15 7:H7的基因组和特异性大质粒pO15 7上与细菌致病性有关的主要致病因子的研究进展。