荧光假单胞菌GcM5-1A重组鞭毛蛋白的表达及其对黑松细胞的毒性研究

针对松萎蔫病的早期诊断及生物防治,本文利用PCR技术从荧光假单胞菌GcM5-1A的基因组中克隆了鞭毛蛋白编码基因fliC,再将该基因克隆到表达载体pET-15b的NcoI和XhoI位点,构建重组质粒pET-15b-fliC,再将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3),构建工程菌,IPTG诱导工程菌高效表达C-末端具有多聚组氨酸标签的重组鞭毛蛋白,重组蛋白主要以包涵体的形式存在,包涵体经8mol/L尿素溶解,复性并经Ni2+螯合柱亲和层析得到了电泳纯的重组鞭毛蛋白。生测结果表明,重组鞭毛蛋白可引起黑松细胞的大量死亡,与天然鞭毛蛋白对黑松愈伤组织细胞有相似的毒性。该研究为松萎蔫病致病机理的研究奠定了基础。     

黑松银松素合成酶的cDNA克隆及表达研究

松萎蔫病是由松材线虫引起的一种危害性极大的森林病害,为研究黑松对松材线虫的抗性机制,本文利用RT-PCR技术对黑松体内经转录组分析获得的与银松素合成酶mRNA高相似度的序列进行扩增,获得了银松素合成酶cDNA,然后将此银松素合成酶基因(PSL)克隆到表达载体pET-15b上,构建了重组表达质粒pET-15b-PSL,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)后构建工程菌,通过IPTG诱导,工程菌高效表达重组蛋白,经Ni 2+螯合柱亲和层析得到了纯化重组银松素合成酶。该研究为了解黑松银松素合成酶的功能及松萎蔫病抗性松树的培育奠定了基础。     

松材线虫纤维素酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术克隆了松材线虫纤维素酶的编码基因BXC46,克隆基因与已报道的纤维素酶基因BXC10（GenBank登录号：FJ598020.1）的同源性高达99%,将其克隆到表达载体pET-15b上构建了表达载体pET-15b-BXC。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株构建工程菌,SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导了纤维素酶在工程菌中表达。采用Ni2＋-NTA树脂亲和层析部分纯化了重组松材线虫纤维素酶,DNS法进行的活性测定表明,部分纯化的重组蛋白具有纤维素酶的活性,其最适温度为45℃,最适pH为4.0。     

绿色荧光蛋白标记在MEOR中的应用研究

为了充分认识目的优势菌种经油藏运移后在产出水中分布的规律与数量,准确分析和客观评价MEOR现场试验效果,利用绿色荧光蛋白(GFP)基因标记目的菌,通过绿色荧光蛋白跟踪监测目的菌的动态信息。构建含有GFP基因的质粒pET-30a(+)-EGFP,并将其成功导入JD中。对构建的JD(gfp)工程菌进行培养发现,该工程菌在含有Kan质量浓度50μg/mL的培养条件下,重组质粒在JD(gfp)工程菌体内传代稳定,绿色荧光的表达稳定。但是在没有选择压力的培养条件下,重组质粒在JD工程菌胞体内有丢失现象。与野生菌混合培养,JD(gfp)工程菌具有很好的配伍性和竞争性,并且不发生重组质粒的水平转移,因此在环境中释放是安全的。     

产氰混合菌浸出废弃线路板中金的实验研究

利用荧光假单胞菌和绿脓杆菌混合生物浸取废弃线路板中的金元素,通过产氰细菌在生长代谢中产生的次生代谢物CN-与废弃线路板粉末中的金发生络合反应,生成可溶性的金络合物,从而将线路板中的金浸取出来.由于浸金过程存在多种影响因素,本实验选用了混合接种比例、菌液加入量、粉末投加量以及NaCl浓度等因素进行了浸金实验,通过控制各单...     

海藻酸降解菌的筛选及其在刺参发酵饵料制备中的应用

从穿孔海带中筛选出一株能降解海藻中海藻胶且对刺参无致病性的细菌D。经16SrDNA鉴定,该菌株为假交替单胞菌。将该株假单胞菌与实验室保藏的EM菌混合后对海参饵料进行固态发酵,接种量为3%,接种比例为褐藻酸降解菌与EM菌的体积比为1∶2,含水量45%,温度28℃,发酵周期为5d,并对发酵后的饵料品质进行评价。结果表明,发酵饵料气味更鲜香。通过发酵,饵料粗蛋白及还原糖的质量分数分别增加了11.40%和136.31%,粗纤维、粗灰分及褐藻酸的质量分数分别降低了13.17%,16.20%及32.50%。     

大肠杆菌中乙醇合成途径的构建

采用PCR技术扩增了运动发酵单孢菌Zymomonas mobilis的两个产乙醇的关键酶基因pdc和adhⅡ，分别克隆到载体pUC19和pUC18中，形成重组质粒pUC19::pdc和pUC18:adh，从中分离出两基因并串联到经Eco RI酶切的pUC18中，转化大肠杆菌E.coli DH5a获得重组质粒pPA。携带pPA的重组菌Pp a被证明具有丙酮酸脱羧酶酶活且提高了乙醇脱氢酶酶活。通过代谢工程在Escerichia coli中成功地构建了乙醇合成途径。     

大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径的改造及其对工程菌L-组氨酸产量的影响

改造大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径,以提高L-组氨酸的产量．用NTG诱变大肠杆菌M-17（SG^r）,依次赋予其2噻唑丙氨酸（2-TA）和组氨酸氧肟酸盐（HisHx）遗传标记,再以突变株M-18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）基因组为模板,扩增组氨酸操纵子基因,构建出重组质粒pUC118-his—operon,将重组质粒导入突变株M—18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）得到工程菌Ecoli M-19（SG^r＋2．TA^r＋HisHx^r／pUC118-his—operon）．根据硝和prs基因序列分别合成引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pSTV28连接,构建重组质粒pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs,将重组质粒分别转化至工程菌E．coli MZH-19,摇瓶发酵测定重组工程菌L-组氨酸的产量．摇瓶发酵结果显示,L-组氨酸产量与对照株相比,工程菌E．coli M-19提高了4．5倍,双质粒系统重组工程菌E．coli MZH-19、Ecoli MPH-19和E．coil MZPH-19分别提高了5．14、5．78、8．43倍．     

炼油厂有机浮渣的微生物处理方法初探

从炼油厂长期堆放浮渣的土壤中筛选出一株可降解浮渣烃类的细菌SD-1,经鉴定为假单胞菌属,将浮渣与水按1：12的比率混合,以10%接种量,35℃摇瓶培养7天,浮渣降解效果可达90%以上,说明应用微生物处理浮渣是有效可行的。     

荧光假单胞菌RB5产嗜铁素的发酵条件

荧光假单胞菌RB5是从土壤中分离得到的一株对禾谷丝核菌有拮抗作用的细菌.通过CAS法检测分析,发现RB5菌株能产生嗜铁素.为明确荧光假单胞菌RB5产嗜铁素的发酵条件,采用摇瓶培养发酵,利用特异光谱吸收法,研究了不同培养条件对RB5菌株嗜铁素产量的影响.最终得出RB5产嗜铁素的最佳发酵条件:起始pH 7.0,接种量2％,瓶装量90 mL/250 mL,发酵时间48 h,Fe3+质量浓度为0.8 mg/L.抑菌试验表明,优化发酵条件后的RB5发酵液(OD400值2.35)有很显著的抑菌效果,抑制率达65.28％.     

过表达hom基因对谷氨酸棒杆菌发酵L-异亮氨酸的影响

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中hom基因编码的高丝氨酸脱水酶为L-异亮氨酸合成过程的关键酶,本研究通过在L-异亮氨酸生产菌cglutamicum YILW中过表达高丝氨酸脱水酶,考察过表达高丝氨酸脱水酶对发酵卜异亮氨酸产量的影响．以L-异亮氨酸生产菌cglutamicum YILW基因组为模板克隆horn基因,将horn基因与表达载体pXMJ19连接构建出重组质粒pXMJ19-hom,再转入Cglutamicum YILW构建C．glutamicum YILW（pXMJ19．hom）．通过5L罐发酵研究重组质粒对工程菌的生长、耗糖、L-异亮氨酸产量及副产物积累等方面的影响．结果显示,重组酶的表达使菌株对卜苏氨酸的抗反馈抑制作用得到加强．最终L-异亮氨酸和L-蛋氨酸积累量分别为36．5g／L和2．8g／L,分别较出发菌株提高7％和33％,同时L-赖氨酸合成量仅为2．1g／L,较出发菌株降低了63．8％．     

生孢噬纤维菌CMcase基因的分离与表达

从生孢噬纤维菌中分离完整的基因组DNA,经过PstI限制性内切酶部分酶切后,在T4DNA连接酶作用下,将酶切的片段连接到载体pUC18的PstI位点中,然后转化到E.coli DH5α中,构建了基因组文库,经过筛选获得4.2x103个重组子。经过刚果红平板筛选获得了含有CMCase基因片段的重组子,在E.coli中进行表达,E.coli在37℃培养25~30h,培养液中CMCase活力达到22.8U/mL。     

杀线虫海洋细菌G-23的鉴定及培养条件研究

针对危害松属植物的重要病原物松材线虫,本文对采自于青岛近海海域的样品进行细菌分离,得到49株细菌,并采用浸渍法对这些菌株的培养液进行杀线虫活性测定,从中筛选出1株具有较高杀线活性的海洋细菌G-23,将该菌株鉴定为产黑假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens),对菌株G-23的培养条件及所产杀线虫活性物质的稳定性进行研究,结果表明,该菌株产杀线活性物质的最佳培养条件为:初始pH8.0,培养温度25℃,菌龄19h,培养时间3d;在海水浓度为100%的Zobell 2216E培养基中生长,有利于活性物质的产生;该菌株产生的杀线虫物质热稳定性较好,既有极性小的物质,也有水溶性物质,在弱碱性(pH8.0)条件下活性较稳定。该研究可为海洋微生物活性物质的开发利用以及松萎蔫病的生物防治提供了理论依据。     

一株微生物采油菌的16S rDNA鉴定和绿色荧光蛋白分子标记

筛选到一株高效生产多糖的YX菌,油田先导试验证明该菌可以用于微生物调剖提高原油采收率（Microbial Enhanced Oil Recovery,MEOR）.经16SrDNA分析鉴定,YX菌属于肠内杆菌属（Enterobacter.）,为跟踪监测其动态信息,构建表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的重组质粒pET-30a（＋）-EGFP,利用CaCl2法将其转化至YX菌,利用荧光显微镜可以观察到重组YX（GFP）工程菌的绿色荧光.结果表明YX菌可以被绿色荧光蛋白基因标记,用于微生物采油研究.     

过量表达苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌合成L–异亮氨酸的影响

考察过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌发酵生产L-异亮氨酸的影响.将解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶基因ilvA（F383V）连接大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19,过量表达于L-异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILW.经5 L发酵罐分批补料发酵产酸实验,与出发菌株C.glutamicum YILW相比,耗糖高峰期滞后,L-异亮氨酸产量增加了10.3%,副产物L-蛋氨酸、L-赖氨酸含量分别降低了33.3%2、6.5%,发酵液中没有L-苏氨酸的累积,乳酸的累积量增加了41.7%.对发酵稳定期的代谢流分布研究表明,过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶使HMP途径流量增加了31.7%,L-异亮氨酸生物合成途径的代谢流提高了8.5%.     

木塑复合材料润滑剂性能的转矩流变性评价

木塑复合材料挤出工艺中,使用润滑剂可以提高生产效率,改善制品表面性能.在转速、混炼器温度、加料量等优化参数条件下用转矩流变仪研究了不同木粉质量分数时润滑剂SWP201对木粉/高密度聚乙烯(WF/HDPE)复合材料熔体转矩流变行为的影响.结果表明:加入界面相容剂马来酸酐接枝聚乙烯(MAPE)与否,质量分数2%的SWP201能够明显降低相应对照复合材料熔体的平衡转矩(Ma)和熔体温度(T);木粉质量分数在0%～6O%范围内增加时,复合熔体的Ma和T呈明显的增加趋势,稳态时熔体温度(T)与混炼器温度(T0)之差△T从11℃增加到18℃左右,△T值反映不同体系的相对摩擦发热作用.Ma与体系的黏度相关.流变行为不同的样品Ma和△T都不同,一般来说Ma较大的△T也较大.转矩流变方法可用于高填充木塑复合体系的流变性和润滑剂性能评价.     

骨形态发生蛋白-2基因工程菌的构建及可溶性研究

骨形态发生蛋白是一类调节骨组织发育的生长因子,其中骨形态发生蛋白-2诱导成骨活性最强,在骨组织工程研究中最具研究意义.为获得能高效表达溶解性高的人骨形成蛋白-2(BMP-2)的基因工程菌,用PCR方法扩增得到BMP-2的基因序列,直接将PCR产物连接到胞内融合表达型T载体质粒pMT-L上,构建包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、连接肽、6个His、EKsite(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和BMP-2的表达载体,转化E.coli DH5α,经抗性筛选和菌落PCR鉴定,抽提阳性克隆质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3),成功构建可在大肠杆菌细胞质内表达MBP-BMP-2融合蛋白的基因工程菌.工程菌经0.1mmol/L IPTG诱导后,可获得表观分子量约为55kD的以可溶形式表达的BMP-2融合蛋白.     

兔肉香肠保藏中卫生质量变化研究

将自然发酵和控菌发酵的兔肉香肠真空包装制品于25℃保藏90天,序时检测其pH值、TVB-N含量、TBA值等指标变化。结果表明：添加乳酸菌L26（Lactobacillus plantarum）、葡萄球菌C18（Staphylococcus xylosus）、酵母Y163（Debaryomyces hansenii）的菌数比L26：C18：Y163为1：2：1,接种量为1×107cfu/g的控菌发酵兔肉香肠不易氧化,口感鲜嫩,耐保藏,且不合亚硝酸钠,卫生质量明显优于自然发酵产品。