教酒链霉菌L1105木聚糖酶基因xynA原核表达及诱导产酶优化

教酒链霉菌(Streptomyces chartreusis)L1105产木聚糖酶性质优良,具有良好的应用价值。目前,尚未见其酶基因克隆表达的报道。研究将教酒链霉菌L1105木聚糖酶基因xynA克隆、连接、转导至原核表达系统中并研究表达系统在不同的时间、温度及IPTG浓度下诱导表达的产酶活力水平。结果表明:教酒链霉菌L1105木聚糖酶基因原核表达载体成功构建,优化诱导表达的最终条件为诱导25h,诱导温度23℃,加入IPTG浓度为0.7mmol/L,在此条件下,获得最大的酶活力45.07U/mL,较初始酶活值3.94U/mL提高了11.43倍。研究为教酒链霉菌L1105产优良木聚糖酶的工业化应用提供了理论依据。     

卵白蛋白肽复合酶法制备工艺优化及解酒效果

目的:验证卵白蛋白肽的解酒活性,提高鸡蛋产品的附加值。方法:用碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶解卵白蛋白,以乙醇脱氢酶(ADH)激活率为指标,采用响应曲面法优化酶解工艺。通过检测卵白蛋白肽的总抗氧化性、水解度、氨基酸组成及相对分子质量,评估卵白蛋白肽的解酒效果。结果:最佳酶解工艺条件:酶解时间5 h,复合酶用量3 100 U/g,酶解温度50 ℃,料液比(m_卵白蛋白∶V_蒸馏水)3.5∶25 (g/mL),在此条件下得到的卵白蛋白肽ADH激活率为(22.71±0.15)%,总抗氧化能力值为(9.51±0.03) U/mL,水解度为(29.28±0.16)%。卵白蛋白肽富含谷氨酸(9.554 3%)、丙氨酸(3.863 3%)、亮氨酸(5.764 7%)等有益于提高解酒活性的氨基酸,小分子肽(＜1 000 Da)含量超过88.77%。结论:使用复合酶解法制备的卵白蛋白肽具有良好的抗氧化活性和解酒效果。     

发光杆菌产几丁质酶的工艺优化

为提高海洋发光杆菌Photobacterium sp.LG-1产低温几丁质酶的酶活性,利用响应面法对其发酵产酶条件进行了优化。Plackett-Burman实验结果表明,影响菌株产酶的三个主要因素分别为发酵温度、发酵时间和酵母膏含量。菌株产酶的最适条件为：胶体几丁质浓度12.0 g/L、酵母膏浓度4.5 g/L、转速220 r/min、发酵温度20℃、装液量75 mL/250 mL、接种量1%、初始pH7.0、发酵时间120 h,几丁质酶的最大酶活为5.10 U/mL。实际平均酶活经验证与预测酶活相近,几丁质酶活比优化前提高了11.50%。为下一步低温几丁质酶的降解机制研究及在工业中的应用提供参考。     

8种食用菌蛋白及其酶解产物抗氧化活性研究

目的:综合评价8种食用菌(香菇、平菇、杏鲍菇、红菇、大球盖菇、草菇、白玉菇、蟹味菇)蛋白及其酶解产物的抗氧化活性。方法:采用碱性蛋白酶对8种食用菌蛋白进行酶解,以DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性、Fe2+螯合率和还原力为指标,对8种食用菌蛋白及其碱性蛋白酶酶解产物的抗氧化活性进行评价。结果:SDS-PAGE电泳图谱显示,碱性蛋白酶可以有效地将蛋白质水解为小分子的肽和氨基酸;草菇蛋白酶解产物的抗氧化活性最高,DPPH自由基清除能力为(5 140.45±5.35) μg Trolox/g,ABTS自由基清除能力为(6.97±0.27) mmol Trolox/L,Fe²⁺螯合率为(79.86±0.45)%,还原力为0.350±0.001,且含有8种必需氨基酸(230.43±5.35) mg/g和较高抗氧化活性的疏水性氨基酸(209.95±4.95) mg/g、负电荷氨基酸(115.89±2.32) mg/g和芳香族氨基酸(57.86±1.74) mg/g。结论:草菇碱性蛋白酶解产物有较好的抗氧化活性且富含必需氨基酸、疏水性氨基酸、负电荷氨基酸及芳香族氨基酸。     

包埋提高异常威克汉姆酵母醛脱氢酶的稳定性

目的:提高威克汉姆酵母醛脱氢酶在冷藏和胃肠道环境中的稳定性,开发消减胃肠道内活性醛的产品。方法:从6株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)中选取醛脱氢酶(ALDH)活性最高的菌株提取ALDH,采用海藻酸钠—氯化钙法对ALDH进行包埋,研究了包埋对ALDH在冷藏及模拟胃肠道环境中的稳定性。结果:W. anomalus菌株J3、J7、J8、J9、J12、J18产生的ALDH比活力在86.77~482.14 U/mg,菌株J9的ALDH的比活力最高,为482.14 U/mg;最优包埋条件为海藻酸钠3.0%,氯化钙3.0%,包埋酶的活力为480.71 U/g;游离酶在4 ℃下放置5 d酶活下降至50%以下,包埋酶酶活维持在90%以上;在体外模拟胃肠道环境下,游离酶在模拟胃液中10 min内完全失去活性,而包埋酶在胃液环境中3 h酶活保留率为56.39%,肠液中1 h酶活保留率为56.35%。结论:海藻酸钠—氯化钙包埋法可显著提高异常威克汉姆酵母ALDH的稳定性。     

一株几丁质酶产生菌的筛选及产酶条件优化

从浙江省台州市剑门港海区采集海底淤泥样本,以几丁质作为惟一营养因子,筛选出5株几丁质酶产生菌,对其中一株产酶活性较高的菌株从形态学、生理生化、脂肪酸组成及含量、G+C含量、醌型及分子生物学特征进行了鉴定(gene Bank:HM136777)。结果表明,该菌属于慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae),芽生杆菌属(Blastobacter)中的一种,命名为Bradyrhizobiaceae blastobacter SYBC-H2。P-B实验结果显示,几丁质、葡萄糖及玉米浆粉是该菌株产几丁质酶的关键营养因子,利用中心组合设计实验(Contral Composite Design)对该菌株的产酶培养基进行了成分优化,结果表明,当培养基主要成分几丁质、葡萄糖和玉米浆粉质量浓度分别为2.7、0.85、2.64 g/L时,几丁质酶活性最高,达到5.70 U/m L。     

三株产几丁质酶菌株的筛选、产酶条件优化及水解虾壳的研究

目的:筛选鉴定产几丁质酶的菌株并优化其发酵条件,最终应用于虾壳降解研究。方法:以盐城市滩涂海泥为样品,利用平板筛选水解几丁质的菌株,运用生物信息学方法鉴定菌株,通过单因素优化其发酵条件,并将筛选得到的菌株和优化后的发酵条件用于虾壳发酵。结果:鉴定得到三株显著降解胶体几丁质的菌,分别是发光杆菌（Photobacterium sp. LYM-1）、需钠弧菌（Vibrio sp. WM-1）和希瓦氏菌（Shewanella sp. ZXY-1）;优化发酵条件:发光杆菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为NH₄Cl 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为6.5,温度为32 ℃,发酵1 d酶活最高为15.37±0.55 U/mL,是优化前的4.37倍;需钠弧菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为NH₄Cl 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为7.5,温度为22 ℃,发酵2 d酶活最高为40.82±6.03 U/mL,是优化前的1.60倍;希瓦氏菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为(NH₄)₂SO₄ 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为6.5,温度为22 ℃,发酵1 d酶活最高为25.64±3.29 U/mL,是优化前的2.47倍;三株菌均能利用虾壳产几丁质酶,但利用效率均低于几丁质,酶活力分别为10.25±0.95、32.16±2.25和21.81±4.27 U/mL。结论:本研究从盐碱地筛选得到三株产几丁质酶的菌株,优化后酶活力均得到提高,且均能利用虾壳产几丁质酶,为发酵虾壳制备几丁质酶提供新的菌株来源。     

一株产几丁质脱乙酰酶海洋细菌的筛选、鉴定及发酵优化

目的:从海洋样品中筛选产几丁质脱乙酰酶细菌,对菌株进行鉴定和发酵条件优化。方法:利用显色平板从黄海海州湾燕尾港海域的海泥中筛选几丁质脱乙酰酶产生细菌。利用形态学、生理生化特性以及16S r DNA序列分析对菌株进行鉴定。利用单因素实验和正交实验优化菌株发酵条件。结果:筛选获得几丁质脱乙酰酶产生菌MCDA01,经形态学特征、生理生化特性以及16S r DNA序列分析将菌株鉴定为天目不动杆菌(Acinetobacter schindleri)。菌株最佳生长条件为30℃,p H8.0,Na Cl 4%。最佳产酶发酵条件为:发酵时间60 h,发酵温度20℃,培养基起始p H7,装液量20%,诱导剂几丁质浓度1%。在此条件下,产酶量达到201.37 U/m L,比优化前提高了4.14倍。结论:几丁质脱乙酰酶产生菌MCDA01产酶量达到201.37 U/m L,有工业应用潜力。      

柠檬明串珠菌KM20中D-乳酸脱氢酶的特性

目的：分析柠檬明串珠菌中D-乳酸脱氢酶（D-LDH）的酶学特性。方法：对柠檬明串珠菌KM20中D-乳酸脱氢酶基因进行克隆表达并构建表达质粒,转化至Escherichia coli BL21（DE3）中实现过表达。结果：经Ni-NTA柱亲和层析纯化后,D-LDH-1与D-LDH-2编码的蛋白分子质量分别为40.0,38.5 kDa;比活力分别为2.18,153.10 U/mg;在丙酮酸还原中两种酶的最适pH值与最适温度均为8.0与40 ℃;而乳酸氧化时D-LDH-2的最适pH值与最适温度分别为12.0与30 ℃。D-LDH-1与D-LDH-2对草酰乙酸、苯丙酮酸和2-酮戊二酸具有较强的催化能力,且Ca²⁺、Cu²⁺和Na⁺对其酶活性均具有促进作用,Zn²⁺与SDS对酶活性有极高的抑制作用。此外,两种酶对丙酮酸的K_m值分别为2.98,6.11 mmol/L,对丙酮酸的K_cat/K_m分别为6.04×10²,2.28×10⁴ L/（mol·s）,LDH-2对D-乳酸的K_cat/K_m为65.0 L/（mol·s）。结论：D-LDH-1与D-LDH-2为柠檬酸明串珠菌中催化D-乳酸合成的关键酶。     

产低温几丁质酶菌株的筛选、鉴定与产酶条件优化

目的:筛选产低温几丁质酶菌株,并对其进行鉴定及发酵条件优化。方法:本实验以渤海海域海泥为样品,以胶体几丁质为唯一碳源,通过平板筛选法筛选产低温几丁质酶细菌,对其进行形态学鉴定和分子生物学鉴定,并对其发酵产酶条件进行了单因素优化。结果:菌株鉴定结果为发光杆菌(Photobacterium sp.),单因素优化结果为:胶体几丁质12.0 g/L、酵母膏6.0 g/L、发酵温度15 ℃、初始pH7.0、转速为220 r/min、装液量75 mL/250 mL、接种量1%、发酵时间96 h,酶活力达4.566 U/mL,比优化前提高389.91%。结论:为下一步酶学性质研究及低温几丁质酶在工业中的应用提供参考。     

海洋来源产低温几丁质酶菌株的诱变选育及酶学性质研究

为研究菌株Photobacterium sp. LG-1理化性质,提高其产酶活性。利用BIOLOG对其进行生理生化实验,通过紫外诱变、化学诱变及复合诱变进行育种,并对其进行酶学性质及抑菌性研究。结果表明,该菌株复合诱变后酶活达2.690 U/mL,酶活提高率为139.78%;最适反应温度为35 ℃,0 ℃仍具有催化活性;最适反应pH为8.0,在偏碱性环境中有较好的稳定性;Ca2+、K+、Mg2+、Cu2+、Na+对几丁质酶活性有促进作用。LG-1对根霉、黑曲霉、毛霉及玉米腐烂病有抑制活性。     

大肠杆菌重组几丁质酶的表达、包涵体复性及酶学性质研究

通过研究重组几丁质酶在大肠杆菌表达系统中诱导表达的浓度、时间和温度,获得表达的最佳条件。表达产物除了可溶性目的蛋白以外,仍存在于包涵体中。采用透析复性和Ni-NTA亲和层析柱上复性两种方法对包涵体中的目的蛋白进行复性,并比较对目的蛋白产率和比酶活的影响。并考察了亲和层析柱上复性时的上样量、洗脱速率和温度对酶活的影响。结果发现,表达的几丁质酶可以采用透析和亲和层析柱上复性,亲和层析柱上复性的比酶活为1347.7 U/mg,明显高于透析复性,但产率明显低于透析复性。对1 m L的Ni-NTA亲和层析柱,较低浓度的蛋白复性液在0.4 m L·min-1洗脱速率下,降低上样量和温度,可以提高复性效率。复性后的几丁质酶对荧光底物具有较高活性,反应的最适温度为37℃,最适p H为3.8。      

A novel chitinase isolated from Vicia faba and its antifungal activity

A novel chitinase with antifungal activity was isolated from fava bean (Vicia faba) seeds. The protein exhibited a molecular mass of 21.5 kDa in reduced condition while 25.5 kDa in oxidized condition on SDS-PAGE, indicating that there are disulfide bonds inside the molecule. Its N-terminal amino acid sequence was determined to be D-D-V-G-S-V-I-S-A-S-L-F-E-Q-L-L-K-H, showing homologous to those of chitinase and chitinase precursors from leguminous plants. The optimum pH and the optimum temperature for activity toward N-acetyl-d-glucosamine were 5.4 and 50 °C, respectively. The pI was determined to be 8.7 by isoelectric focusing electrophoresis. The chitinase was thermostable up to 58 °C in both enzymatic reaction and antifungal activity. It showed chitin-binding activity, suggesting that the catalytic domain is involved in the binding of chitinase to a certain extent. In addition, it exerted potent antifungal action toward a variety of fungal species including Pythium aphanidermatum, Fusarium solani, Physalospora piricola, Alternaria alternate, Botrytis cinerea, and Fusarium oxysporum f. sp. melonis. The present findings demonstrated a novel chitinase with disulfide bonds inside the molecule and show antifungal significance in agriculture.     

绿僵菌Ma83固态发酵几丁质酶和部分酶学性质的初步研究

研究了金龟子绿僵菌MetarhiziumanisopliaeMa83菌株产几丁质酶的固态发酵条件和粗酶液的酶学性质。研究结果显示 ,当以麸皮∶蚕蛹粉为 3∶1作为培养基 ,最适氮源为1%NaNO3,起始pH为 6 5 ,发酵温度为 31℃ ,接种量为 2mL液态种子时酶活力最高。此外 ,添加稻壳对Ma83产几丁质酶有促进作用。该菌株在生长 2d时 ,酶活力达 33 9U /g干培养基。酶的最适反应温度为 5 0℃ ,最适反应 pH为 6 0 ;不同温度保温 1h后 ,酶的半失活温度为 42℃。不同 pH值的缓冲溶液中 (2 5℃ )放置 1h后 ,酶在pH 5 0～ 6 0条件下稳定性最高     

Two catalytic domains of Chlorella virus CVK2 chitinase

VChti-1 chitinase encoded by the Chlorella virus CVK2 contained two catalytic domains belonging to family 18 glycosyl hydrolases. The first catalytic domain on a C-terminal-truncated derivative of vChti-1 generated exclusively chitobiose from chitotetraose, chitohexaose, and colloidal high-molecular mass chitin in the enzyme reaction, a typical characteristic of an exochitinase. In contrast, N-acetylglucosamine was produced from chitobiose as well as from chitooligosaccharides by the second catalytic domain on an N-terminal-truncated derivative of vChti-1. Therefore, the second domain possessed N-acetylglucosaminidase activity as well as endochitinase activity. The presence of two catalytic domains with different enzymatic properties in the viral enzyme seems to be necessary for hydrolyzing natural substrates in a cooperative fashion.     

酸橙内生菌Bacillus thuringiensis Bt028几丁质酶的分离纯化及其酶学性质

为揭示酸橙内生菌Bacillus thuringiensis Bt028几丁质酶的基本酶学性质,采用离心、硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶G-100层析及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法对菌株Bt028发酵液中的几丁质酶进行分离纯化鉴定,并考察该几丁质酶的最适温度、最适pH、催化动力学参数等性质。结果表明,Bt028菌株发酵液经离心、硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶G-100层析分离纯化后获得电泳纯几丁质酶比活力为681.78 U/mg,纯化倍数为3.21,回收率15.52%。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,几丁质酶的分子质量为65 kDa。酶学性质研究结果表明,该酶的最适反应温度为60 ℃,最适反应pH为6.5,在温度低于60 ℃、pH5.5~7.5时有较好的稳定性;Mg2+、Ca2+、Hg2+、Co2+对该酶活力有抑制作用,而Cu2+和Fe3+有一定的促进作用;低浓度的甲醇、乙醇、正丙醇和二甲亚砜使酶的活性增加,但当浓度继续增大,反而会抑制酶的活性;丙酮对几丁质酶有激活作用,而甲醛对几丁质酶有抑制作用。在最适催化条件下,几丁质酶催化反应的米氏常数Km、最大反应速率Vmax、酶的转换数Kcat分别为29.533 mg/mL、108.696 μmoL/(L·min)和0.527/min。研究结果可为该酶的实际应用提供必要的工艺参数。     

产几丁质降解酶菌株的筛选及其产酶条件

采用平板透明圈法从土壤中分离筛选到一株产几丁质降解酶菌株L12酶活力为0．63U／mL。通过产酶条件优化，初步确定了该菌株较适产酶培养基和摇瓶发酵条件。条件优化后酶活力提高约1．6倍，达到1．06U／mL。