枯草芽孢杆菌B2(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛.将编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-XYN.初步研究表明:以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程菌摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可迭1542.6 U/mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性.     

枯草芽孢杆菌B2（Bacillus subtiIis B2）木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛。将编码枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis B2）木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115／pPIC9K-XYN。初步研究表明：以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程茵摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可达1542.6U／mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性。     

耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

将一种11家族极端耐热木聚糖酶的密码子优化基因Syxyn11克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-Syxyn11,将其经SalⅠ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。经G418筛选得到重组工程菌GS115/Syxyn11,用甲醇诱导表达重组木聚糖酶SyXyn11,酶活可达到17.74 U/mL。SDS-PAGE显示,SyXyn11的相对分子质量为31 000。SyXyn11的最适反应温度为85℃,在80℃以下稳定。最适反应pH为6.5,在pH 5.0~7.5范围内稳定。EDTA和大多数金属离子对重组酶的活性影响不大。结果表明Syxyn11成功在P.pastoris GS115中实现表达,而且重组木聚糖酶的耐热性并未改变。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达

为大规模制备β-葡萄糖苷酶,构建重组酵母工程菌,实现β-葡萄糖苷酶的分泌表达。根据已报道黑曲霉(Aspergillus niger)β-葡萄糖苷酶cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR扩增,获得黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl)。构建了pMD-18T-bgl克隆载体,bgl亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-bgl。经BglⅡ线性化后电转入Pichia pastoris GS115,经过MD、YPD/G418平板筛选阳性克隆,获得分泌表达重组P.pastoris GS115的工程菌。用终体积分数1%的甲醇对其进行诱导表达,SDS-PAGE和酶活测定结果表明,重组毕赤酵母分泌了1个相对分子质量约90 000的蛋白质,与该酶基因产物的理论值一致。酶催化的最适温度为50℃,最适pH 5.5,其酶活达到38 U/mL,比已报导重组酶产酶水平有较大程度的提高。     

合成嗜热酸性淀粉酶的毕赤酵母表达

把密码子优化后的超耐热酸性α-淀粉酶的基因BD5088,引入载体pPIC9K中,将正确构建的重组质粒pPIC9K-BD5088转化毕赤酵母GS115细胞,得到酵母工程菌株。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,重组超耐热酸性α-淀粉酶PrBD5088在甲醇酵母中大量表达并分泌到胞外。该酶受甲醇的严格调控和诱导,在诱导培养5 d后酶活力达到最大值,表达量可达到约200 mg/L。与原核表达产物ErBD5088相比,PrBD5088的酶学性质发生了一定的改变。其最适反应温度由80℃增加到90℃。最适反应pH值仍为pH5.6,但范围更宽,在pH值5.0～6.5之间,其相对酶活在90%以上,在pH4.0～8.0范围内酶活性保留50%以上。而ErBD5088则只在pH5.0～7.0范围内能维持活性的50%以上。且PrBD5088的温度稳定性远高于ErBD5088。PrBD5088在100℃条件下热处理1 h仍具有80%以上的酶活力,而ErBD5088相同条件下的半衰期只有20 min。此外,Ca2+和Zn2+对维持rBD5088活性和稳定性会产生轻微促进作用,该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用。SDS-PAGE测得该酶的分子量为56 ku,高于原核表达的酶蛋白。重组α-淀粉酶PrBD5088不存在N-连接的糖基化,但是存在O-连接的糖基化现象。本实验结果表明O-连接糖基化可适当提高PrBD5088的热稳定性、最适温度和酸性pH条件下酶活性。     

黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

以黑曲霉Aspergillus niger基因组DNA为模板,PCR扩增出酸性α-淀粉酶的结构基因,将此基因插入载体pPIC9K,重组质粒pPIC9K-asAA转化毕赤酵母SMD1168,并通过G418平板培养基筛选高拷贝转化子。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,酸性α-淀粉酶大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,摇瓶培养中,2%甲醇诱导培养168h后酶活力达到最大值2838U/mL。SDS-PAGE结果显示该重组酶的分子质量为58kD。该酶的最适反应pH值为4.0,在pH3.0～6.0之间酶活力基本保持稳定,最适反应温度为70℃,在工业生产常用温度50℃条件下,该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。重组毕赤酵母遗传稳定性良好。     

朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

α-1,6-葡聚糖酶是专一作用于α-1,6糖苷键产生小分子葡聚糖的一类水解酶,广泛的运用于制糖工业和啤酒工业中。采用PCR法扩增朱黄青霉（Penicillium minioluteum）C12114的α-1,6-葡聚糖酶基因,将其插入毕赤酵母表达载体pPIC9K。经SacI酶线性化电击转入毕赤酵母基因组,构建重组酵母GS115/pPIC9K-dex。对构建成功的转化子进行1.5%的甲醇诱导表达,在30℃条件下培养7d时酶活达到最大值,为88.35U/mL。      

樟绒枝霉α-淀粉酶在毕赤酵母中的高效表达及在麦芽糖浆制备中的作用

从嗜热真菌樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)中克隆α-淀粉酶基因McAmyA,并在毕赤酵母GS115中高效表达,经高密度发酵至168 h时,胞外酶活力达到13 440. 6 U/mL。重组α-淀粉酶McAmyA粗酶液经QSFF强阴离子交换层析纯化得到电泳级纯酶,比酶活力为1 230. 2 U/mg。酶学性质研究表明,重组α-淀粉酶McAmyA的最适pH和最适温度分别是6. 5和65℃。以淀粉液化液为底物,在温度60℃,加酶量120 U/g,水解24 h的条件下,重组α-淀粉酶McAmyA水解液化液,制备得到麦芽糖含量为50. 0%(质量分数)的麦芽糖浆。该真菌α-淀粉酶在毕赤酵母中表达水平高,具有很大的应用潜力。     

Streptomyces septatus磷脂酶D在毕赤酵母中的重组表达及酶学性质分析

以Streptomyces septatus TCCC 21057基因组为模板,扩增得到磷脂酶D(phospholipase D,PLD)基因(pld),经合成获得pld密码子优化基因(pldm),以pPIC9K为表达载体,毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为宿主菌株,构建获得毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-pldm,摇瓶发酵后获得的重组PLD(rPLDM)转酯活力达2.37 U/mL;rPLDM经纯化后进行转酯酶学性质分析,其最适作用温度为60℃,最适作用pH值为6.5;在单水相反应体系中,40℃、pH 6.5、Ca²⁺浓度10 mmol/L、大豆磷脂酰胆碱和L-丝氨酸物质的量比1∶10、rPLDM添加4.0 U/mL,反应6 h后,磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)的产率可达到33%。本研究通过对rPLDM的重组表达、转酯酶学性质及催化合成PS的研究,为进一步实现酶法合成新资源食品PS奠定了基础。     

朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶在毕赤酵母GS115中的异源表达

目的构建毕赤酵母基因工程菌,以实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。方法人工合成朱黄青霉HI-4的α-1,6-葡聚糖酶基因ZHdex,克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,电转入毕赤酵母GS115。甲醇诱导目的蛋白表达。结果成功在毕赤酵母GS115中对ZHdex基因进行表达,SDS-PAGE表明重组毕赤酵母在66×103附近有目的蛋白表达,与理论值一致。在摇瓶水平,甲醇诱导培养120 h后,α-1,6-葡聚糖酶的最高酶活达28.79 U/mL,蛋白质浓度为0.56 mg/mL。结论获得一株重组毕赤酵母GS115-ZHdex,其产物具备α-1,6-葡聚糖酶活性,成功地实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。     

麦芽寡糖醇高效制备新方法的研究

麦芽寡糖醇是近年来发现的现代食品工业中重要的糖醇,其中由麦芽三糖衍生而得的麦芽三糖醇的含量决定了其质量与用途。以玉米淀粉为原料,首先研究耐高温α-淀粉酶对淀粉的液化作用,制得特定液化度的淀粉液化液;然后探究普鲁兰酶、β-淀粉酶和中温α-淀粉酶在淀粉糖化阶段的作用,获得高麦芽三糖含量的低聚麦芽寡糖。由此通过加氢反应制得高麦芽三糖醇含量的低聚麦芽寡糖醇。淀粉液化与糖化的最佳条件是:以25%(w/v)淀粉乳开始,控制淀粉液化后的DE值为20,分别按8、100、16 U/g的添加量同步加入普鲁兰酶、β-淀粉酶和中温α-淀粉酶,在pH5.5、55℃下糖化10 h。所得糖液经加氢制得的糖醇中麦芽三糖醇占42.18%、麦芽糖醇占48.51%,总低聚糖醇转化率达到98.76%。研究结果可指导高品质麦芽寡糖醇及其相关产品的高效制造。     

展示在毕赤酵母表面稻米脂肪酶的性质研究

人工合成酵母菌壁蛋白(GCW14)与稻米脂肪酶(RL)组合基因(GCW14-RL),将其亚克隆到pPIC9k载体后转化到GS115酵母菌中,成功构建了pPIC9k-GCW14-Rlipase载体,并将RL展示在毕赤酵母GS115表面;同时对其酶学性质进行研究,发现其在30~45℃的温度范围都能发挥作用,最适pH为8.0,重复使用5次依然可以保持80%以上的活性。     

麦芽糖转糖基酶在毕赤酵母中的表达及活性分析

用PCR 方法从E.coli BL21(DE3)中获得麦芽糖转糖基酶基因,将该基因插入到酵母表达载体pPIC9K 的α分泌信号开放阅读框的下游,对重组质粒pPIC9K-MalQ 所含的外源片段进行双向测序。将测序正确的重组质粒用内切酶Sal Ⅰ线性化,电穿孔转化到GS115 感受态细胞中,G418 梯度筛选高拷贝转化菌及PCR 鉴定目的基因的整合,1% 甲醇诱导表达。经薄层色谱分析粗酶液处理的麦芽二糖溶液,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基酶活性。     

菊糖果糖转移酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

将PCR获得的不包含信号肽序列的菊糖果糖转移酶基因(ift)与毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K进行连接,构建重组载体pPIC9 K-IFTase.重组载体经线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞,利用G418抗性梯度筛选及PCR鉴定,获得一株高拷贝菊糖果糖转移酶重组毕赤酵母菌株.该重组菌株经甲醇诱导,能够分泌具有活性的菊糖果糖转移酶,且60h时酶活为10.3U/mL.结果表明,菊糖果糖转移酶可以实现在毕赤酵母的分泌表达.     

宇佐美曲霉阿魏酸酯酶A基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究通过RT-PCR技术从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001中克隆了编码阿魏酸酯酶A的成熟肽cDNA(AusfaeA),构建重组表达质粒pPIC9K-AusfaeA,将其经SacⅠ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,通过抗G418筛选获得高拷贝重组子GS115/AusfaeA,用甲醇诱导表达重组阿魏酸酯酶(reAusFaeA)。SDS-PAGE显示,纯化后的reAusFaeA为单一条带,其表观相对分子质量为36 000;以阿魏酸甲酯为底物,经高效液相色谱法测定,该酶的酶活为29.4 U/mg;reAusFaeA的最适反应温度为45℃,并在45℃以下稳定;最适反应pH为5.0,在pH 4.0~6.0范围内稳定;多数测定的金属离子及EDTA对该酶的活性影响不大。结果表明在P.pastoris中成功实现了AusfaeA的异源表达,该重组酶优良的酶学性质表明其具有较大的工业应用潜力。     

枯草芽孢杆菌壳聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达及其酶解特性

研究枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因（BsCsn46）在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中的高效表达、重组酶性质及其酶解特性。重组菌在5 L发酵罐高密度发酵后胞外酶活力高达50 370 U/mL,蛋白质量浓度15.7 mg/mL。粗酶经强阴离子交换层析纯化,纯酶比活力为4 065.7 U/mg,最适pH 6.0,最适温度55 ℃,在45 ℃以下保持稳定。该酶水解3 g/100 mL壳聚糖得到主产物为二糖、三糖和四糖的壳寡糖,水解率为92.8%,壳寡糖得率为90.9%。本研究的重组壳聚糖酶产酶水平和水解效率高,为工业化制备壳聚糖酶及大规模制备壳寡糖的应用提供了理论支持。     

淀粉液化芽孢杆菌BS5582中性蛋白酶基因的克隆表达及其酶学性质研究

以一株高产中性蛋白酶的Bacillus amyloliquefaciens BS5582基因组DNA为模板,PCR扩增获得结构基因npr,构建质粒pPIC9K-npr,并转化到表达菌株毕赤酵母GS115中得到重组菌。经甲醇诱导发酵,测定中性蛋白酶活性。结果表明,目的基因大小为1566bp,在宿主中得到了成功表达,重组菌酶活力为9.17×103U/g,酶学性质分析表明,重组中性蛋白酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为7,在40℃中保温1h后仍能保持85%左右活性,在pH4～9的范围内稳定性较好,Ca2+、Mg2+、Mn2+离子对该酶有激活作用。      

淀粉液化芽孢杆菌BS5582中性蛋白酶基因的克隆表达及其酶学性质研究

以一株高产中性蛋白酶的Bacillus amyloliquefaciens BS5582基因组DNA为模板,PCR扩增获得结构基因npr,构建质粒pPIC9K-npr,并转化到表达菌株毕赤酵母GS115中得到重组菌。经甲醇诱导发酵,测定中性蛋白酶活性。结果表明,目的基因大小为1566bp,在宿主中得到了成功表达,重组菌酶活力为9.17×103U/g,酶学性质分析表明,重组中性蛋白酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为7,在40℃中保温1h后仍能保持85%左右活性,在pH4～9的范围内稳定性较好,Ca2+、Mg2+、Mn2+离子对该酶有激活作用。     

α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE在毕赤酵母中的表达及应用

α-L-鼠李糖苷酶对天然产物之间的转化具有重要的作用和应用价值.该研究采用毕赤酵母表达 α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE,构建pPIC9K-AnRhaE表达载体,电转化至毕赤酵母GS115和KM71H中,经诱导表达,SDS-PAGE电泳显示GS115更有利于生产AnRhaE酶.AnRhaE酶在45～55℃时酶活力高,最适...     

菊糖果糖转移酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

将PCR获得的不包含信号肽序列的菊糖果糖转移酶基因（ift）与毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K进行连接,构建重组载体pPIC9K-IFTase。重组载体经线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞,利用G418抗性梯度筛选及PCR鉴定,获得一株高拷贝菊糖果糖转移酶重组毕赤酵母菌株。该重组菌株经甲醇诱导,能够分泌具有活性的菊糖果糖转移酶,且60h时酶活为10.3U/mL。结果表明,菊糖果糖转移酶可以实现在毕赤酵母的分泌表达。