蛹虫草胞外多糖的提取纯化及免疫活性研究

目的 提取纯化蛹虫草发酵液中的胞外多糖,初步研究其结构及免疫活性.方法 乙醇沉淀多糖,用Sevag法除去蛋白质、透析法除去小分子物质,经CM-52纤维素柱层析后得纯品.用紫外光谱测定多糖纯度,用凝胶柱层析法测定相对分子质量,高效毛细管电泳和红外光谱分析其分子结构,检测胞外多糖对小鼠巨噬细胞系RAW264.7产生NO的影响.结果 蛹虫草胞外多糖经脱蛋白、CM-52纤维素柱层析后可获得单一对称峰的纯多糖,相对分子质量为3.49 × 104,含羟基、糖醛结构和羰基结构,单糖基之一为甘露糖.多糖可显著刺激巨噬细胞分泌NO,具有活化免疫细胞、增强机体免疫力的作用.结论 该方法可获得高纯度蛹虫草胞外多糖,并证明它对巨噬细胞有活化作用.     

蛹虫草多糖的纯化及其分子量的测定

以蛹虫草子实体为材料,对水提醇沉、硫酸锌盐去蛋白后获得蛹虫草粗多糖（CP）进行分离纯化。采用膜分离技术、DEAE．52柱层析及SephadexG-100柱层析对CP进行分离纯化,并使用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定各组分多糖分子量,以表征不同路径所得多糖的分子量分布。结果表明：CP经膜过滤、DEAE-52柱层析及SephadexG-100进一步柱层析得到多糖组分CP2-c2-s2,经HPGPC法鉴定,CP2-c2-s2为均一多糖组分,其平均分子量为20200Da。     

蛹虫草胞外多糖的制备、结构分析及其免疫活性

本实验选择蛹虫草菌株CICC 14014液态发酵培养，提取蛹虫草胞外多糖，测定其理化性质及结构，并对其免疫活性进行研究。采用DEAE-Sephacel阴离子交换柱联合Sephadex G-200葡聚糖凝胶柱纯化蛹虫草胞外多糖；利用高效液相色谱法测定多糖分子质量，利用傅里叶变换红外光谱鉴定多糖结构；选用BALB/c小鼠构建免疫损伤模型，考察其体质量及免疫器官指数变化情况，观察其脾脏组织切片形态，计算其T、B细胞增殖率，测定其血清细胞因子及免疫球蛋白质量浓度。结果表明，蛹虫草发酵液中多糖质量浓度为3.15 mg/mL，经分离纯化后所得单一多糖分子质量为3.67 kDa，纯度可达86.13%。动物实验结果表明，蛹虫草胞外多糖可明显提高免疫器官指数，能够有效促使T细胞（低剂量时）、B细胞增殖和免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、IgA、IgM、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-2、干扰素（interferon，IFN）-γ的分泌，免疫调节效果显著。研究结果表明蛹虫草胞外多糖可修复环磷酰胺导致的BALB/c小鼠免疫功能损伤，为开发蛹虫草发酵液资源建立了部分理论支撑。     

蛹虫草胞外锌多糖抗氧化能力的研究

以蛹虫草为材料通过液体深层富锌培养获得胞外富锌多糖,测定了蛹虫草胞外富锌多糖的锌含量和抗氧化性能,即清除氧自由基、羟自由基和DPPH的能力。实验结果表明:蛹虫草富锌培养基内ZnSO4浓度在150μg/mL下,可以显著提高胞外锌多糖的有机锌含量(P<0.01),使有机锌含量达到0.87mg/g,比对照提高295%。有机锌对提高胞外锌多糖清除自由基的能力有显著的促进作用(P<0.01),清除氧自由基、羟自由基和DPPH的能力分别是对照的7.05%、23.5%和17.49%;胞外锌多糖对自由基的清除能力与多糖浓度呈明显的剂量-效应关系(P<0.01)。     

蓝光对蛹虫草多糖含量的影响

蛹虫草菌种在两种不同的液体培养基(其中一种添加奶粉)中经摇发酵培养后,再在静置培养过程中以蓝光照射蛹虫草菌丝体,研究蓝光照射对其产生胞内和胞外多糖含量的影响。结果表明,在不含有奶粉的液体培养基表面生长蛹虫草菌丝体,其胞外多糖和胞内多糖含量受蓝光照射的影响而降低;而在培养基中加入奶粉以后,蓝光照射时也可降低胞内多糖的相对含量,但使蛹虫草胞外多糖含量稍有增加。     

毛竹竹叶多糖分离与纯化技术研究

对毛竹叶采用超声波提取法获得的竹叶多糖粗提取物,采用Sevag法脱蛋白质、乙醇分级沉淀、冷冻干燥后得到粗多糖,进一步用DEAE-52纤维素柱层析、Sephadex葡聚糖凝胶柱层析等方法分离纯化.结果表明:Sevag法脱蛋白3次可脱除97.2%的蛋白质;50%浓度的乙醇沉淀多糖得率最高,为37.6%;DEAE-52纤维素柱层析柱水沈脱的得牢最高,为46.4%;DEAE-52纤维素柱层析柱2次水洗脱获得的竹叶多糖经G-75柱层析和G-100柱层析可得到白色粉末状的中性多糖.选择水和NaCl溶液为洗脱剂的温和条件分离纯化多糖效果较好.     

虫草多糖醇沉和DEAE-32纤维素柱层析特性研究

分级醇沉、分步醇沉和DEAE-32纤维素柱层析法研究了虫草多糖的分子量和多糖组分分布.分级醇沉实验表明,各醇沉浓度对应的得率都随醇浓度的升高而呈增加趋势,多糖含量变化起伏较大,醇浓度为30%和70%时所得多糖含量较高,虫草胞内和胞外多糖分子量分布都很不均匀;分步醇沉测定了各部分多糖所占的比例.DEAE-32纤维素柱层析实验结果表明:冬虫夏草的胞外多糖和胞内多糖具有分子量相似的中性多糖峰,并且它们的含量较为接近;二者的酸性多糖组分也具有相似的规律.     

蛹虫草固体发酵培养基多糖的分离纯化及组成分析

为研究蛹虫草固体发酵培养基中多糖的分离纯化及组成,本实验利用水提醇沉法与Sevage法相结合,得到蛹虫草固体发酵培养基粗多糖(CMSMP).经DEAE-cellulose 52柱层析分离得到纯化蛹虫草固体发酵培养基多糖组分(CMSMPI)后,采用紫外光谱、醋酸纤维素薄膜电泳和Sephadex G-150凝胶柱层析鉴定其纯度,高效液相色谱及红外光谱分析其组成、结构.结果表明,CMMSP1为均一多糖,且由木糖、阿拉伯糖和葡萄糖三种单糖组成.同时红外光谱显示,CMSMP1具有典型多糖吸收峰.     

蛹虫草乙醇分级多糖生理功能研究

为了探讨不同浓度乙醇分级虫草多糖的生理功能,以蛹虫草为材料通过液态深层发酵获得发酵液和菌丝体,用水浸提,以不同浓度的乙醇沉淀来获得蛹虫草胞内、胞外多糖,同时以果蝇为材料测定了不同浓度的乙醇分级虫草胞内、胞外多糖的抗氧化性、抗菌性等生理功能。结果表明,70%的醇沉多糖量最多,可使胞内、胞外多糖的得率分别为1.513 mg/mL、0.483 mg/mL;70%的醇沉胞外多糖具有较好的抗氧化性,可使果蝇体内的SOD值达到1.261 U/mgprot,比对照组高13.13%,使MDA值达到0.019 nmol/mgprot,比对照组低67.2%;70%的醇沉胞内多糖抗菌性最好,可使黑曲霉的抑菌圈直径达13.4 mm、大肠杆菌的抑菌圈直径达11.3mm,分别是对照组直径的2.19和1.85倍。     

蛹虫草高产胞外虫草素和虫草多糖的诱变育种

通过诱变获得高产胞外虫草素和虫草多糖的蛹虫草菌株.采用紫外线诱变(UV)、化学诱变(LiCl)、复合诱变(UV-LiCl) 3种方式对蛹虫草孢子进行诱变;发酵检测存活菌株的胞外虫草素和虫草多糖的含量.结果:以胞外虫草素为指标,3种诱变方式的最大正突变率分别为化学突变(29.2％)＞紫外突变(28.6％)＞复合诱变(26.5％);以胞外多糖为指标,最大正突变率分别为紫外诱变(35.7％)＞复合诱变(33.3％)＞化学诱变(27.0％).紫外诱变突变株Z-5-1胞外虫草素产量达0.842g/L,比出发菌株高311％;紫外诱变突变株Z-4-7胞外虫草多糖产量达5.250g/L,比出发菌株高148％.在连续培养5代后,仍具有较好的遗传稳定性.紫外诱变能获得较高的蛹虫草正突变率,同时能获得高产虫草素、虫草多糖的突变株.     

虫草多糖对环磷酰胺诱导微核的抑制作用

研究了虫草胞内、胞外多糖对环磷酰胺诱导的蚕豆根尖细胞微核的影响,结果表明,虫草胞内、胞外多糖可有效抑制环磷酰胺诱导的蚕豆根尖细胞微核的产生,其抑制作用随着虫草胞内、外多糖浓度的增大而增强,当多糖浓度为100μg/mL时,环磷酰胺诱导的蚕豆根尖细胞微核率最低,分别为7.333‰和7.556‰;抑制率达到最高,分别为53.52%和52.11%。     

虫草多糖对丝裂霉素诱发蚕豆根尖细胞微核的影响

目的:研究虫草多糖对丝裂霉素诱发的蚕豆根尖细胞微核的影响。方法:采用蚕豆根尖细胞微核试验。结果:浓度分别为100、80、50μg/ml的虫草胞内、胞外多糖对浓度为0.5μg/ml丝裂霉素诱发的蚕豆根尖微核率与阳性对照组(0.5μg/ml丝裂霉素)均具有极显著差异(p<0.01),虫草胞内、外多糖对微核的最大抑制率分别为60.48%、62.20%;浓度为30μg/ml的虫草胞内、外多糖对浓度为0.5μg/ml丝裂霉素诱发的蚕豆根尖微核率与阳性对照组(0.5μg/ml丝裂霉素)有显著的差异(p<0.05);四种浓度的胞内、外多糖之间对微核的影响至少存在显著的差异(p<0.05),且蚕豆根尖细胞微核率随多糖浓度的提高而降低。结论:虫草胞内、胞外多糖均可有效抑制丝裂霉素诱导的蚕豆根尖细胞微核的产生。     

不同固态培养基对蛹虫草子实体品质的影响

通过测定不同固态培养基培养蛹虫草子实体的生长情况,虫草素、虫草酸、虫草多糖含量,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率及2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除能力,研究不固态培养基对蛹虫草子实体品质的影响。结果表明,不同固体培养基培养蛹虫草子实体的活性物质与抗氧化活性差异显著（P＜0.05）,其中小米+麦麸培养基培养蛹虫草子实体的生长情况较佳,出芽时间最快,为12 d,子实体最长,为（6.50±0.15） cm,鲜质量最重,为（8.58±0.07） g,其虫草素和虫草酸含量最高,分别为（6.53±0.06） mg/g和（7.66±0.21） mg/g;薏仁米培养基培养蛹虫草子实体虫草多糖含量最高,为（59.07±1.89） mg/g,薏仁米＋麦麸培养基抗氧化活性最强,DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率分别为（66.84±0.77）%、（68.28±0.26）%。     

北冬虫夏草保健酒的研制

以人工培育的北冬虫夏草为原料,清香型白酒为酒基,采用酒浸提方法,利用L9（34）正交实验,确定浸出物多糖浸出的最佳工艺。再以浸提液、蜂蜜、纯净水配制成保健酒。实验得到了北冬虫夏草浸提最佳工艺条件为：酒基浓度55%vol,浸提时间30d,浸提温度25℃。     

泰山虫草菌丝体与冬虫夏草有效成分的TLCS分析

以腺苷、尿苷、次黄嘌呤核苷、虫草素及次黄嘌呤为指标,测定泰山虫草菌丝体与天然冬虫夏草中相应成分的含量,探索泰山虫草代替天然冬虫夏草开发药物或保健食品的可能性。采用80%乙醇超声提取,在GF254硅胶板上点样后,以薄层色谱扫描法(TLCS)测定上述各种成分的含量。首次证明泰山虫草菌丝体核苷类及次黄嘌呤等有效成分含量明显高于冬虫夏草。其腺苷、尿苷、次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤含量分别是冬虫夏草的8.25倍、3.76倍、11.8倍和1.55倍。2种虫草中有效成分的含量均表现为尿苷>次黄嘌呤核苷>腺苷>次黄嘌呤>虫草素。说明泰山虫草可以作为冬虫夏草代用品进行综合开发利用。TLCS法简捷快速,重现性、稳定性良好,能有效地对虫草中的有效成分进行定性定量分析。     

响应面法优化复方北冬虫夏草颗粒多糖提取工艺的研究

采用Box-Behnken设计星点响应面法对复方北冬虫夏草颗粒中多糖提取工艺进行优化研究。通过单因素试验考察料液比、提取时间和浸泡时间、提取次数4个因素对多糖得率的影响;通过Box-Behnken设计星点响应面试验,对北冬虫夏草、灵芝、甘草、大枣、小麦和桔梗中多糖提取工艺进行优化试验。优化后的提取工艺为:料液比1∶16.75(g/mL)、提取时间2 h、浸泡时间2.4 h、提取次数3次。通过Box-Behnken星点响应面试验方法进行的提取工艺优化,试验结果合理有效,优化效果良好。     

九州虫草菌丝体多糖Ck_3-A的分离纯化及其理化性质研究

以九州虫草 (Cordycepskyushuensis Kobayasi)发酵菌丝体为试验材料 ,采用水提法得到九州虫草菌丝体粗多糖。粗多糖经酶法结合Sevag法除蛋白、H2 O2 法脱色、透析、分级沉淀得到Ck3 ,Ck3 经DE 2 3柱层析得到多糖Ck3 A。经紫外扫描、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Sepharose 4B柱层析等方法检测确定Ck3 A为均一组分。用苯酚 硫酸法测得Ck3 A的含糖量为 73 1% ,硫酸 咔唑法测得Ck3 A含有微量的葡萄糖醛酸。Sepharose 4B柱层析测得Ck3 A的分子量为 92 5 0 0u。红外光谱结果显示Ck3 A含有α 型糖苷键。     

人工蛹虫草固体培养残基中虫草素的提取分离研究

以人工蛹虫草固体培养残基为原料,采用索氏提取后,用离子交换层析进行分离研究。索氏提取结果表明水比乙醇更优于提取虫草素;离子交换层析分离提取固体培养残基中虫草素的正交实验表明洗脱流速、料水比为主要影响因子,最优条件为:料水比1:16,离子柱pH3.5;洗脱流速为1滴/2秒。