蛹虫草胞外多糖的提取纯化及免疫活性研究

目的 提取纯化蛹虫草发酵液中的胞外多糖,初步研究其结构及免疫活性.方法 乙醇沉淀多糖,用Sevag法除去蛋白质、透析法除去小分子物质,经CM-52纤维素柱层析后得纯品.用紫外光谱测定多糖纯度,用凝胶柱层析法测定相对分子质量,高效毛细管电泳和红外光谱分析其分子结构,检测胞外多糖对小鼠巨噬细胞系RAW264.7产生NO的影响.结果 蛹虫草胞外多糖经脱蛋白、CM-52纤维素柱层析后可获得单一对称峰的纯多糖,相对分子质量为3.49 × 104,含羟基、糖醛结构和羰基结构,单糖基之一为甘露糖.多糖可显著刺激巨噬细胞分泌NO,具有活化免疫细胞、增强机体免疫力的作用.结论 该方法可获得高纯度蛹虫草胞外多糖,并证明它对巨噬细胞有活化作用.     

蛹虫草高产胞外虫草素和虫草多糖的诱变育种

通过诱变获得高产胞外虫草素和虫草多糖的蛹虫草菌株.采用紫外线诱变(UV)、化学诱变(LiCl)、复合诱变(UV-LiCl) 3种方式对蛹虫草孢子进行诱变;发酵检测存活菌株的胞外虫草素和虫草多糖的含量.结果:以胞外虫草素为指标,3种诱变方式的最大正突变率分别为化学突变(29.2％)＞紫外突变(28.6％)＞复合诱变(26.5％);以胞外多糖为指标,最大正突变率分别为紫外诱变(35.7％)＞复合诱变(33.3％)＞化学诱变(27.0％).紫外诱变突变株Z-5-1胞外虫草素产量达0.842g/L,比出发菌株高311％;紫外诱变突变株Z-4-7胞外虫草多糖产量达5.250g/L,比出发菌株高148％.在连续培养5代后,仍具有较好的遗传稳定性.紫外诱变能获得较高的蛹虫草正突变率,同时能获得高产虫草素、虫草多糖的突变株.     

蛹虫草胞外锌多糖抗氧化能力的研究

以蛹虫草为材料通过液体深层富锌培养获得胞外富锌多糖,测定了蛹虫草胞外富锌多糖的锌含量和抗氧化性能,即清除氧自由基、羟自由基和DPPH的能力。实验结果表明:蛹虫草富锌培养基内ZnSO4浓度在150μg/mL下,可以显著提高胞外锌多糖的有机锌含量(P<0.01),使有机锌含量达到0.87mg/g,比对照提高295%。有机锌对提高胞外锌多糖清除自由基的能力有显著的促进作用(P<0.01),清除氧自由基、羟自由基和DPPH的能力分别是对照的7.05%、23.5%和17.49%;胞外锌多糖对自由基的清除能力与多糖浓度呈明显的剂量-效应关系(P<0.01)。     

蛹虫草胞外多糖的制备、结构分析及其免疫活性

本实验选择蛹虫草菌株CICC 14014液态发酵培养,提取蛹虫草胞外多糖,测定其理化性质及结构,并对其免疫活性进行研究。采用DEAE-Sephacel阴离子交换柱联合Sephadex G-200葡聚糖凝胶柱纯化蛹虫草胞外多糖;利用高效液相色谱法测定多糖分子质量,利用傅里叶变换红外光谱鉴定多糖结构;选用BALB/c小鼠构建免疫损伤模型,考察其体质量及免疫器官指数变化情况,观察其脾脏组织切片形态,计算其T、B细胞增殖率,测定其血清细胞因子及免疫球蛋白质量浓度。结果表明,蛹虫草发酵液中多糖质量浓度为3.15 mg/mL,经分离纯化后所得单一多糖分子质量为3.67 kDa,纯度可达86.13%。动物实验结果表明,蛹虫草胞外多糖可明显提高免疫器官指数,能够有效促使T细胞（低剂量时）、B细胞增殖和免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）G、IgA、IgM、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素（interleukin,IL）-6、IL-2、干扰素（interferon,IFN）-γ的分泌,免疫调节效果显著。研究结果表明蛹虫草胞外多糖可修复环磷酰胺导致的BALB/c小鼠免疫功能损伤,为开发蛹虫草发酵液资源建立了部分理论支撑。     

蛹虫草菌胞外多糖发酵动力学的研究

对蛹虫草胞外多糖的发酵过程和发酵动力学进行了研究。基于菌丝体的定义(dCx/dt=μCx)和菌丝体比生长速率μ[μ=μ(t)],得到了描述发酵过程中菌丝体生长和胞外多糖生成的数学模型,同时对实验数据与模型进行了比较,结果拟合良好,说明此模型较好地反映了蛹虫草胞外多糖的发酵过程及其动力学机制。      

蛹虫草多糖提取纯化工艺研究

为能更好地产业化开发利用蛹虫草,对蛹虫草多糖的提取纯化工艺进行研究。通过正交试验探讨了料液比、提取温度和提取时间对多糖提取率的影响,在此基础上通过分析不同的醇沉和去蛋白纯化条件,确定蛹虫草多糖的最佳制备工艺。结果表明,最佳工艺为先在液料比30∶1(V∶m)、提取温度70℃和提取时间4h下提取多糖,然后在浓缩液浓度为14%、乙醇溶液浓度为80%下进行醇沉,再调节多糖溶液的pH=3并加入4%的硫酸锌。整个工艺多糖提取率为8.97%,纯度高达68.9%,有良好的去杂纯化效果且多糖损失较小。该研究为产业化生产蛹虫草多糖提供了基础数据。     

关于蛹虫草菌多糖发酵及培养基的研究

研究了蛹虫草胞外多糖发酵过程，分析不同因素对胞外多糖得率的影响，获得了比较适宜的培养基组成和发酵条件。蛹虫草胞外多糖优化发酵培养基组成为：蔗糖12％，玉米浆2％，酵母膏2％，硝酸钾0．45％；发酵培养条件为：pH值6．5，温度20℃。此条件下蛹虫草胞外多糖得率为1．188g／100mL，菌丝体干重为1．221g／100mL。     

蛹虫草培养基多糖的提取及抗肿瘤活性研究

为综合利用蛹虫草小麦培养基,研究培养基多糖的提取和开发。在热回流水提法和超声波水提法单因素试验的基础上,采用热回流水提法正交试验筛选蛹虫草小麦培养基粗多糖最佳的提取工艺;用 MTT法检测了不同处理提纯多糖的抗肿瘤活性。结果表明热回流水提法提取培养基粗多糖效果优于超声波水提法;提取温度100 ℃、料液比1 g∶25 mL、提取3次、每次提取时间90 min,为最佳培养基粗多糖提取工艺;影响粗多糖提取效率的4个因素的主次关系是：提取温度>提取时间>提取次数>料液比;粗多糖的得率随着醇沉浓度的提高而提高。MTT试验发现质量浓度为5 mg/mL、培养时间72 h,培养基脱脂脱蛋白多糖A对HepG2肝癌细胞抑制率可达到83.02%,培养基脱脂多糖B的抑制率可达到75.39%,培养基未脱脂脱蛋白粗多糖C抑制率为30.61%,提纯多糖表现出较高的抑制率;100 ℃热回流水提蛹虫草子实体脱脂脱蛋白多糖F,质量浓度为5 mg/mL、培养72 h后,对Hepg2细胞抑制率平均值达到92.974%,与对照顺铂（SB）无显著差异,与多糖A差异显著。     

蛹虫草培养基多糖的超声波提取及抗氧化性研究

研究用超声波提取蛹虫草培养基中粗多糖的工艺条件,并比较了该多糖与蛹虫草子实体多糖的抗氧化性。结果表明:在料液比1∶30(质量比),乙醇用量15 mL,超声波功率70 W,超声时间90 min的条件下,蛹虫草培养基中多糖含量为3.30%。在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL浓度范围内蛹虫草培养基多糖与子实体多糖抗氧化能力相似,且具有一定的量效关系。红外显示两种多糖结构相同。     

蛹虫草虫草多糖的分离纯化、分子构象分析及抗氧化活性研究

选用蛹虫草粗多糖进行分离纯化,借助二乙氨基乙基纤维素52(DEAE-52)柱层析得到虫草中性多糖(Cordyceps militaris polysaccharide,CMP)。采用紫外可见光谱(UV-visible)和傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)表征CMP,同时选用气质联用技术(GC-MS)测定单糖组成,并采用多角度激光光散射凝胶渗透色谱和示差联用(gel permeation chromatographymulti-angle laser light scattering-reflective index,GPC-MALLS-RI)测定CMP重均分子质量(MW)和均方根旋转半径(Rg),同时分析CMP在溶液中的构象。此外,对粗多糖和CMP的抗氧化活性进行比较。结果表明:经DEAE-52水洗的中性多糖CMP质量分数为76. 63%,比粗多糖(44. 95%)纯度提高70. 48%;在260 nm和280 nm处均无明显紫外吸收; FT-IR说明CMP为α-构型多糖;其单糖组成为甘露糖、葡萄糖和半乳糖,摩尔比为1∶3. 90∶1. 51; MW和Rg分别为2. 432×107g/mol,31 nm;CMP在溶液状态下为高枝化度结构。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)和2,2'-联氨-双-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)自由基清除实验表明,CMP具有明显的抗氧化活性,且自由基清除率高于粗多糖。     

不同固态培养基对蛹虫草子实体品质的影响

通过测定不同固态培养基培养蛹虫草子实体的生长情况,虫草素、虫草酸、虫草多糖含量,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率及2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除能力,研究不固态培养基对蛹虫草子实体品质的影响。结果表明,不同固体培养基培养蛹虫草子实体的活性物质与抗氧化活性差异显著（P＜0.05）,其中小米+麦麸培养基培养蛹虫草子实体的生长情况较佳,出芽时间最快,为12 d,子实体最长,为（6.50±0.15） cm,鲜质量最重,为（8.58±0.07） g,其虫草素和虫草酸含量最高,分别为（6.53±0.06） mg/g和（7.66±0.21） mg/g;薏仁米培养基培养蛹虫草子实体虫草多糖含量最高,为（59.07±1.89） mg/g,薏仁米＋麦麸培养基抗氧化活性最强,DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率分别为（66.84±0.77）%、（68.28±0.26）%。     

蛹虫草子实体多糖抗突变作用

研究蛹虫草多糖(CMPS)对环磷酰胺(CTX)诱导小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核形成率及染色体畸变率的影响,探讨其抗突变作用。采用微核实验和染色体畸变实验技术,镜下观察并计数。结果显示:CMPS三个剂量组小鼠微核抑制率分别为29.75%、36.20%、44.48%,抑制率随剂量增多呈增加趋势,各剂量组与环磷酰胺组比较,均有显著性差异(p<0.05);CMPS三个剂量组染色体畸变率分别为36.7%±5.46%、20.8%±3.52%、18.1%±3.28%,畸变率随CMPS剂量增多呈下降趋势。蛹虫草多糖可降低环磷酰胺诱导小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率及染色体畸变率,具有抗突变活性。      

蛹虫草多糖的提取及对小鼠脾细胞增殖的影响

采用超声波-微波协同法提取蛹虫草多糖,并研究其对小鼠脾细胞增殖的影响,初步评价其免疫活性。通过单因素和L18(37)正交试验研究了物料粒度、料液比、超声波功率、超声波时间、超声提取次数、提取温度、乙醇与浓缩液之比对蛹虫草多糖提取率的影响。正交试验结果表明,超声波功率、物料粒度对蛹虫草多糖的得率均呈现出显著的影响,进而确定蛹虫草多糖提取最优工艺参数:物料粒度0.150 mm,提取次数为3次,微波功率400 W,超声波功率300 W,超声波处理时间30 min,提取温度70℃,料液比1∶40(g/mL),乙醇与浓缩液之比4∶1(体积比)。在最佳条件下,可得到多糖提取率为6.28%。小鼠脾细胞增殖试验表明,在一定的剂量内,提取到的蛹虫草多糖能明显促进小鼠脾细胞的增殖,表明蛹虫草多糖具有免疫调节活性。     

蛹虫草基质多糖纳米硒复合物的制备研究

以多糖为软模板,可以制备高效低毒的纳米硒-多糖复合物。本文以废弃的蛹虫草培养基质中提取的水溶性多糖为原料,研究了蛹虫草基质多糖纳米硒复合物的制备工艺及抗肿瘤活性。实验结果表明,在多糖浓度为10 mg/m L、亚硒酸浓度为0.4 mol/L、混合时间为4 h、滴加速度为1.5 r/min的条件下,可以制备出形貌理想、粒径适宜、稳定性良好的蛹虫草基质多糖纳米硒复合物。该复合物对Caco-2肿瘤细胞的生长具有一定抑制效果,且对细胞毒作用呈现出剂量依赖效应。      

虫草花多糖提取工艺优化及其抗氧化特性

采用超声辅助法提取虫草花多糖,在单因素试验的基础上,通过L9（34）正交试验优化了虫草花多糖提取工艺;并就虫草花多糖对羟基自由基（·OH）、1,1-苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基的清除作用和还原能力进行研究。结果表明：虫草花多糖最佳提取工艺条件为超声功率300 W,液料比30∶1（mL∶g）,超声时间30 min,超声温度45 ℃。在此优化条件下,多糖的平均提取率为3.88%。抗氧化活性试验结果表明,虫草花多糖质量浓度在2.9～14.7 mg/L范围内,随着虫草花多糖质量浓度的增加,其OH、DPPH自由基清除能力及还原能力均逐渐增强,虫草花多糖质量浓度为14.7 mg/L时,对·OH和DPPH·清除率分别达到44.39%和56.34%,说明虫草花多糖具有较强的抗氧化活性。     

蛹虫草乙醇分级多糖生理功能研究

为了探讨不同浓度乙醇分级虫草多糖的生理功能,以蛹虫草为材料通过液态深层发酵获得发酵液和菌丝体,用水浸提,以不同浓度的乙醇沉淀来获得蛹虫草胞内、胞外多糖,同时以果蝇为材料测定了不同浓度的乙醇分级虫草胞内、胞外多糖的抗氧化性、抗菌性等生理功能。结果表明,70%的醇沉多糖量最多,可使胞内、胞外多糖的得率分别为1.513 mg/mL、0.483 mg/mL;70%的醇沉胞外多糖具有较好的抗氧化性,可使果蝇体内的SOD值达到1.261 U/mgprot,比对照组高13.13%,使MDA值达到0.019 nmol/mgprot,比对照组低67.2%;70%的醇沉胞内多糖抗菌性最好,可使黑曲霉的抑菌圈直径达13.4 mm、大肠杆菌的抑菌圈直径达11.3mm,分别是对照组直径的2.19和1.85倍。     

不同复合碳源对蛹虫草生长的影响

蛹虫草子实体可药食两用,具有广阔的研究前景.该文主要研究了不同复合碳源对蛹虫草子实体培养过程的影响.研究发现,蛹虫草在以小麦为复合碳源的培养基中长势最好,所得子实体中虫草多糖的含量也最高.     

北虫草发酵过程中营养成分及代谢物变化研究

研究了北虫草摇瓶发酵过程中培养基营养成分及其代谢物质变化情况,测定了培养基的pH、总糖、还原糖和可溶性蛋白及游离氨基酸等成分含量,探明了北虫草菌体生长、多糖及虫草素生成规律。结果显示:随发酵时间的延长,发酵液的pH、可溶性固形物、总糖和还原糖含量均总体呈下降趋势;游离氨基酸含量呈先变化迟缓而后上升趋势;北虫草菌丝体及虫草素产量随时间延长先增加后下降;粗多糖含量总体略呈下降趋势。      

蛹虫草多糖的纯化及其分子量的测定

以蛹虫草子实体为材料,对水提醇沉、硫酸锌盐去蛋白后获得蛹虫草粗多糖（CP）进行分离纯化。采用膜分离技术、DEAE．52柱层析及SephadexG-100柱层析对CP进行分离纯化,并使用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定各组分多糖分子量,以表征不同路径所得多糖的分子量分布。结果表明：CP经膜过滤、DEAE-52柱层析及SephadexG-100进一步柱层析得到多糖组分CP2-c2-s2,经HPGPC法鉴定,CP2-c2-s2为均一多糖组分,其平均分子量为20200Da。