牛血清中牛腹泻病毒牛肾细胞直接病变检测方法的建立

目的建立牛血清中牛腹泻病毒(BVDV)的牛肾细胞直接病变检测法。方法将样品接种至牛肾(CK)细胞上,通过观察细胞病变,判定样品是否污染BVDV。结合病毒增殖曲线及不同培养时间的检出率,确定最佳判定时间,并对检测方法进行验证及应用。结果该方法的最佳判定时间为10d;测定限度为100～240CCID50/ml;样品冻融次数及不同批次的牛血清样品对试验结果影响较大;应用该方法检测134批牛血清样品,BVDV污染率约为7.5%。结论已建立牛血清中牛腹泻病毒牛肾细胞直接病变检测法。     

狂犬病病毒滴度直接免疫荧光检测法的建立及验证

目的 建立狂犬病病毒滴度的直接免疫荧光检测法,并进行验证.方法 将狂犬病病毒Pitman-Moore株(PM株)病毒液进行5倍系列稀释后,感染MRC-5细胞,37℃培养24 ～ 30 h;用FITC标记的抗狂犬病病毒特异性抗体进行染色,通过计数病毒感染细胞的荧光灶数计算病毒滴度,并验证方法的重复性、中间精密度及线性范围...     

直接免疫荧光法检测狂犬病病毒滴度条件的优化及验证

目的对直接免疫荧光法检测狂犬病病毒(rabies virus,RV)滴度的条件进行优化及验证。方法考察直接免疫荧光法中细胞不同接种方式(分步接种法、一步接种法)、病毒不同培养温度(34、37℃)及培养时间(6、12、24、48、72、96 h)对狂犬病病毒滴度的影响;对优化的方法进行试验间精密性和特异性验证,并与小鼠脑内滴定法的检测结果进行比较。结果选择一步接种法作为直接免疫荧光法的细胞接种方式;34℃作为病毒培养温度;病毒培养至96 h时进行染色,判定实验结果;病毒培养至第3天时进行荧光灶计数,计算病毒液中病毒的数量。两名操作人员12次检测结果的变异系数仅为0.05%;用该方法检测不同病毒,仅狂犬病病毒组出现特异性荧光,而犬瘟热病毒和犬细小病毒组未观察到荧光灶。采用直接免疫荧光法和小鼠脑内滴定法检测狂犬病病毒样品的病毒滴度结果差异无统计学意义(P0.05),具有较好的一致性。结论优化的直接免疫荧光法精密性良好,特异性强,操作简便,检测周期短,可用于狂犬病病毒滴度的定量检测。     

进口胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒的分离及鉴定

目的对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)进行分离及鉴定。方法Trizol法提取待检胎牛血清中的病毒RNA后,利用套式RT-PCR扩增BVDV,并利用生物信息学Lasergene 7.0软件对其核苷酸序列进行同源性分析。取生长状态良好的MDBK细胞,按1%比例加入待检胎牛血清,收获F1代BVDV FBS2014,反复冻融3次后,再次接种MDBK细胞,连传4代。采用荧光定量RT-PCR法、间接免疫荧光试验及抗原捕获ELISA法对收获的病毒进行鉴定。结果扩增产物大小均与预期相符,与已报道的BVDV-1 NADL株的核苷酸序列一致性为92.2%,属于BVDV-1a亚型毒株;分离的病毒经鉴定为BVDV,命名为BVDV FBS2014,病毒基因拷贝数为10~4拷贝/μl,感染MDBK细胞可见特异性绿色荧光;各代次的病毒收获液中BVDV的基因拷贝数均大于10~(4.92)拷贝/μl,BVDV抗原检测结果均为阳性。结论购买的进口胎牛血清中成功分离到可致MDBK细胞产生细胞病变的病毒,经鉴定所分离的病毒为BVDV,命名为FBS2014株,该病毒属于BVDV-1a亚型毒株。     

检测牛血清中污染大肠杆菌噬菌体方法的建立

用大肠杆菌标准噬菌体株选择确定的大肠杆菌44451和44369作为宿主菌，建立了检测牛血清污染大肠杆菌噬菌体的直接噬菌斑法和增殖法。此法操作简便、灵敏度高。     

新生牛血清快速筛选方法的建立

目的 建立适用于疫苗生产车间的新生牛血清(newborn bovine serum,NBS)快速筛选方法.方法 以12批NBS(编号为A、B、D、E、F、G、H、I、J、K、L、、M)作为待评价血清,制备细胞培养液,采用细胞收获量测定法、微量终点稀释测定法、相对增长率测定法、细胞3次连续传代培养法、细胞倍增时间测定法5...     

O型口蹄疫病毒血清抗体竞争ELISA检测方法的建立及验证

目的建立O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)血清抗体的竞争ELISA检测方法,并进行验证。方法采用O型FMDV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)作为包被抗原,建立用于检测FMDV血清抗体的竞争ELISA方法。对方法的抗原包被浓度(0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0μg/mL)、抗原包被温度及时间(4℃过夜、37℃1 h、37℃1.5 h、37℃2 h、37℃2. 5 h、37℃3 h)、血清稀释度(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释)、HRP-IgG稀释度(1∶10 000～1∶20 000稀释)、封闭液种类(不封闭、1%BSA封闭、2%BSA封闭、5%脱脂乳封闭)、封闭液作用时间(30、60、90、120 min)、血清与HRP-IgG作用时间(30、60、90、120、150 min)、底物TMB作用时间(10、15、20、25、30 min)进行优化。同时验证方法的交叉反应、特异性及敏感性、精密性。采用建立的方法及O型FMDV抗体液相阻断EL...     

低浓度牛血清培养Vero细胞的研究

用人血浆组分IV中某些成分配制的低浓度牛血清（2％）培养液（称Ⅱ号培养液），培养Vero细胞的效果与美国GIBCO公司的低浓度牛血清培养基添加物Gms－A类似；用所培养的Vero细胞感染狂犬病毒，其病毒滴度均大于6．0logLD50／ml）；而残余牛血清含量从50～100μg／ml降至5～10μg／ml。     

国产牛血清的现状

本文概述了牛血清中的生长因子、激素、贴壁和扩展因子、结合蛋白质等 8种主要成分在细胞培养中的重要作用 ;全面介绍了自 2 0 0 0年版《中国生物制品规程》颁布生物制品用牛血清质量标准以来 ,国产牛血清的现状。 4年间 ,牛血清在质量管理GMP化 ,生产模式产业化 ,加工工艺现代化 ,产品开发多元化 ,人员培训系统化等方面取得了长足的进步 ;目前与国外产品的差距主要表现在现行质量标准有局限性 ,生产规模小 ,技术、设备、工艺落后 ,品种单一 ,在生产用牛的溯源管理上不完善等。了解这些 ,对进一步推动国产牛血清产业的发展大有益处     

应用定量动态浊度法检测牛血清中的内毒素

目的　应用定量动态浊度法检测牛血清中细菌内毒素。方法　应用BET 32B型细菌内毒素测定仪 ,应用定量动态浊度法检测牛血清中内毒素含量。同时与鲎试剂凝胶法进行比较。结果　采用该法可定量检测牛血清中内毒素含量 ,变异系数≤ 10 % ,快速简捷 ,一次检测样品多 ,稳定性好 ,精确度、灵敏度高 ,可以在 0 0 0 1～ 10EU/ml的范围内定量 ,与鲎试剂凝胶法测定结果比较 ,符合率达 96 2 %。结论　应用BET 32B型细菌内毒素测定仪 ,采用定量动态浊度法检测牛血清中内毒素的方法准确性好 ,性能稳定 ,具有广阔的应用前景。     

测定含甘油牛血清白蛋白样品Lowry法的优化及验证

目的优化《中国药典》三部(2015版)通则50中Lowry法2试验条件,进一步提高检测结果的准确性,并进行方法学验证,为柱纯化组分百日咳疫苗中间品蛋白准确定量提供参考。方法用Lowry法2测定经脱氧胆酸钠-三氯乙酸预处理的不同浓度且含50%甘油的牛血清白蛋白,使福林酚反应在20℃水浴条件下分别静置30、40和50 min,筛选出蛋白含量测定值相对误差最小的反应时间;再在10、20和30℃条件下,筛选出相对误差最小的反应温度。对该方法进行精密度、准确度、专属性验证,并确定线性范围。结果福林酚反应温度为30℃、反应时间为30 min时,测定值的平均相对误差最低,与其他试验条件的差异有统计学意义(P0.05)。在该试验条件下,同一工作日不同试验人员间及同一试验人员不同工作日检测结果的RSD均小于2.00%,重复性检测结果 RSD为0.50%,精密度良好;30、50和70μg/m L蛋白溶液测定值的RSD均小于2.00%,回收率在99%~102%之间,可对蛋白准确定量;含甘油50μg/m L蛋白溶液的回收率及其RSD分别为102%和0.50%;不含甘油对照组回收率和RSD分别为100%和0.82%,专属性良好;在0~140μg/m L标准范围内,检测含甘油样品的测定范围在15~140μg。结论采用Lowry法2测定含高浓度甘油的蛋白样品时,福林酚反应温度、反应时间是影响试验结果的重要因素。30℃条件下反应30 min,可提高测定结果的准确性,符合且更有利于柱纯化组分百日咳疫苗中间品的蛋白定量的要求。     

乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒PCR检测方法的建立及验证

目的建立乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1,PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法参照Gen Bank中登录的PCV1(AY193712)及PCV2序列(AY181946)设计引物,以提取的PCV1和PCV2基因组DNA为模板,分别经PCR扩增726 bp的PCV1片段和433 bp的PCV2片段,并对PCR反应中的退火温度、引物浓度、Mg2+浓度参数进行优化。将PCR扩增产物分别与p MD18-T载体连接,连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,测序并进行同源性分析。对优化的PCR方法进行灵敏度和特异性验证,并用该方法检测3批乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、4批明胶和10批胰蛋白酶中的PCV1和PCV2。结果确定PCR反应的退火温度为54℃,引物浓度为10μmol/L,Mg2+浓度为10 mmol∕L。扩增的目的基因测序结果与Gen Bank中发布的PCV1及PCV2序列的同源性均为100%。建立的PCR方法最低可检出10 pg的目的基因;该方法只对PCV1和PCV2基因组DNA能扩增出特异性条带。用该方法检测乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、明胶和胰蛋白酶,均未检出PCV1和PCV2。结论成功建立了乙型脑炎减毒活疫苗中PCV1和PCV2的PCR检测方法,该方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,可用于乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批及两种猪源性原材料的PCV1和PCV2污染检测。     

皮内注射用卡介苗特异性鉴别试验多重PCR检测方法的建立及验证

目的建立皮内注射用卡介苗(Bacillus Calmette Guerin vaccine,BCG)特异性鉴别试验的多重PCR法,并进行验证。方法根据GenBank登录的Pasteur 1173P2株序列(AM408590. 1)设计并合成引物,以制备的BCG特异性鉴别试验国家参考品(简称BCG鉴别参考品)DNA为模板,多重PCR法扩增其特异性缺失区RD1,产物经3%琼脂糖凝胶电泳鉴定,验证方法的重复性、中间精密度、特异性、耐用性及灵敏度;采用该方法检测8批皮内注射用BCG供试品。结果 BCG鉴别参考品在重复检测6次、2名检测人员分别重复检测3 d、不同PCR退火温度及不同DNA聚合酶加量时均扩增出约200 bp的核酸片段;最低可检10 pg/mL的目的基因,仅对结核分枝杆菌H37Rv及皮内注射用BCG样品DNA扩增出特异性条带。经该方法检测,8批供试品PCR产物电泳均可见单一的目的条带,无RD1序列存在,大小与BCG鉴别参考品一致。结论多重PCR法的重复性、中间精密度、特异性、耐用性及灵敏度良好,可应用于皮内注射用BCG特异性鉴别试验。     

重组人IL-12病毒去除/灭活工艺的建立及验证

目的建立重组人白细胞介素-12(recombinant human IL-12,rhIL-12)的病毒去除/灭活工艺,并进行验证。方法采用预过滤器(Viresolve Shield,纳米滤膜3.1 cm2)和除细小病毒过滤器(Viresolve Pro,纳米滤膜3.1 cm2)串联过滤,样品体积为90 ml,过滤时间为2 h,安全系数为1.88,压力为30 psi,建立rhIL-12病毒去除工艺,分析该工艺对产品的比活性及回收率的影响,并以猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)作为指示病毒,对该工艺进行病毒去除效果验证;采用低pH孵放法(用1 mol/L HCl调pH值至3.8±0.1,室温放置180 min后,用1 mol/L NaOH调pH值至7.4)建立rhIL-12病毒灭活工艺,分析该工艺对产品的蛋白含量及比活性的影响,并分别以水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)和伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)作为指示病毒,对该工艺进行病毒灭活效果验证。结果纳米膜串联过滤病毒去除工艺中,蛋白回收率为95.14%,比活性为过滤前的95.12%,对rhIL-12活性基本无影响;当滤出液达90 ml时,PPV下降滴度均大于4 log10,符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求。低pH孵放法病毒灭活工艺中,rhIL-12的蛋白含量在病毒灭活前后分别为359和338μg/ml,生物学活性分别为3.392×106和3.356×106 IU,均无明显变化;室温处理180 min后,指示病毒PRV、VSV的下降滴度均4 log10,符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求。结论建立的rhIL-12膜过滤病毒去除工艺和低pH孵放法病毒灭活工艺均可有效地去除/灭活病毒,保证了产品的质量及安全性。     

人用疫苗及生产用细胞中猪圆环病毒PCR检测方法的建立及验证

目的建立人用疫苗及生产用细胞中猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1,PCV1)和2型(PCV2)PCR检测方法,并进行验证。方法参照Gen Bank中登录的PCV1(KC447455)和PCV2(AY578327)序列,全基因组合成PCV1和PCV2基因序列,以合成的PCV1和PCV2全基因组序列DNA为模板,进行PCR扩增,对PCR反应中的退火温度进行优化。对优化后的PCR方法进行灵敏度和特异性验证,并用该方法检测疫苗生产用细胞KMB_(17)、Vero工作种子批、脊髓灰质炎减毒活疫苗(oral poliomyelitis vaccine,OPV)收获液、冻干甲型肝炎减毒活疫苗(freeze-dried hepatitis A vaccine,f HAV)成品、肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗收获液及成品、Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine prepared with Sabin strain,SIPV)收获液及成品的PCV1和PCV2。结果优化后的退火温度为63℃,建立的PCR方法最低可检测出10~(-1)fg/μL的目的基因,仅对PCV基因组DNA能扩增出特异性条带。用该方法检测生产用细胞KMB_(17)及Vero工作种子批、OPV收获液、f HAV成品、EV71灭活疫苗收获液及成品、SIPV收获液及成品,均未检出PCV1和PCV2。结论成功建立了生产用细胞种子、疫苗收获液及成品中PCV的PCR检测方法,该方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,能够用于本所生物制品生产用细胞种子、疫苗收获液及成品中PCV污染的检测,从而提高生物制品的安全性。     

西尼罗病毒抗体间接ELISA检测方法的建立、验证及其应用

目的建立及验证西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)抗体间接ELISA检测方法,并用于评价疫苗的免疫效果。方法以纯化后的WNV E蛋白第三结构域(EDⅢ)蛋白作为包被抗原,建立WNV抗体间接ELISA检测方法,对抗原包被浓度(2.5、5、10、20、40、80μg/ml)、血清稀释度(1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320)、抗原封闭时间(0.5、1、1.5、2 h)、血清孵育时间(0.5、1、1.5、2 h)、HRP标记的山羊抗马Ig G稀释倍数(1:5 000、1:10 000、1:20 000、1:40 000、1:80 000稀释)及其孵育时间(0.5、1、1.5、2 h)进行优化,并验证该方法的特异性、敏感性及精密性。采用建立的方法检测WNV阴性马血清和病毒样颗粒(WNV-VLPs)疫苗免疫的马血清,与ALPHA公司试剂盒的检测结果进行比较。结果间接ELISA法最佳检测条件为:抗原包被浓度为20μg/ml,4℃包被过夜;Blocking ACE封闭液于37℃封闭1.5 h;加入血清(1:80稀释),37℃孵育1.5 h;加入HRP标记的山羊抗马Ig G(1:20 000稀释),37℃孵育1 h。该方法可特异性检测WNV阳性血清中的WNVE-Ig G抗体;阳性血清稀释至1:2 560时,检测结果仍为阳性;批内和批间的变异系数(CV)均小于7%。25份WNV阴性马血清检测结果均为WNVE-Ig G抗体阴性,经WNV-VLPs疫苗免疫的马血清中的WNVE-Ig G抗体效价水平随免疫次数的增加呈递增趋势,间接ELISA法与ALPHA公司试剂盒的检测结果完全一致。结论成功建立了WNV抗体间接ELISA检测方法,可用于疫苗免疫效果的评价,为开展WNV流行病学调查、诊断及新型疫苗的研发奠定了基础。     

人血清中猪抗人淋巴免疫球蛋白双抗体夹心ELISA检测法的建立及验证

目的建立人血清中猪抗人淋巴免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin,ALG)双抗体夹心ELISA检测法,并进行验证。方法以兔抗猪Ig G包被酶标板,HRP酶标记的鼠抗猪Ig G为二抗,建立人血清中ALG含量的双抗体夹心ELISA检测法,并对方法中包被浓度及二抗浓度进行优化,同时验证该方法的重复性、敏感性、准确性、特异性及稳定性。采用优化后的方法对14位严重型再生障碍性贫血(severe aplastic anemia,SAA)患者进行ALG的血药浓度监测(therapeutic drug monitoring,TDM)。结果最佳包被浓度为1∶2 000,最佳二抗稀释度为1∶8 000。参考品浓度在4.9~5 000μg/ml范围内标准曲线的四参数Logistic曲线拟合较好,R2值为0.991 1,在4.9~156μg/ml范围内的线性拟合也较好,R2值为0.991 5,批内重复性CV值均10%;其检测底限为0.39μg/ml;浓度为500、50及5μg/ml参考品的回收率为91.2%~107.0%;该方法可特异性检测出注射ALG患者血清中ALG含量;包被好的ELISA板及二抗、底物于4及37℃条件下分别保存1~3周及1~3 d后检测结果均较稳定。经DAS 3.1.4软件分析,14名经ALG治疗的SAA患者血清中ALG的曲线下面积(AOC)为(7.3±5.1)mg/(L·d)(95%CI),半衰期(t1/2)为(20.65±38.67)d(95%CI)。结论该方法具有良好的重复性、准确度及稳定性,可用于ALG的TDM。