用于单克隆抗体纯化的仿生多肽超大孔PGMA微球制备及其性能

以仿生多肽配基FYEILHC为亲和配基、以葡聚糖修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯[Dextran-poly(glycidyl methacrylate), Dextran-PGMA]超大孔微球为基质，制备用于单克隆抗体纯化的仿生多肽超大孔PGMA微球，在环氧氯丙烷中滴加2 mol/LNaOH使其表面衍生出环氧基，在表面修饰FYEILHC；用扫描电镜表征微球表面形貌，用AKTA蛋白纯化系统考察了Dextran-PGMA微球和琼脂糖微球对抗体的动态吸附量随线性流速的变化。结果表明，偶联FYEILHC后Dextran-PGMA微球仍能保持其大孔结构，在923 cm/h线性流速下，其对抗体的动态吸附量仅下降约8%，而琼脂糖微球的动态吸附量则迅速下降25%。表明在较高流速下，抗体在Dextran-PGMA微球上的传质性能较好。吸附?用0.1 mol/L NaOH原位清洗重复40次后，Dextran-PGMA微球对抗体的动态吸附量约为(21?1) mg/mL，表明微球具有良好的化学稳定性；血清中回收的抗体纯度为95.0%，表明仿生多肽亲和介质具有从复杂生物样品中纯化抗体的巨大潜力，可满足高流速、高通量抗体分离纯化需求。     

多肽配基亲和吸附介质的配基密度控制规律

以谷胱甘肽为配基,琼脂糖微球为骨架,探索将谷胱甘肽通过共价键偶联到琼脂糖微球骨架上,制备可以分离谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferase, GST)及以其为标签的融合蛋白的亲和吸附介质.采用正交实验方法考察了谷胱甘肽加入量、偶联缓冲液的pH值和反应温度对亲和介质配基密度的影响.结果发现,该反应过程中的pH值对配基密度影响最大,其次为谷胱甘肽的加入量.用所制备的亲和吸附介质纯化GST(大鼠肝脏谷胱甘肽S转移酶),发现GST的吸附量随配基密度增加而增加,但GST活性却随配基密度的增加而下降,较好的干胶配基密度为260 μmol/g.大鼠肝匀浆液经过离子交换和亲和层析两个步骤,获得了电泳纯的GST,比活力为12.08 U/mg,总活性回收率为40%以上.     

氟虫腈为配基的亲和介质制备及鱼类GABA受体纯化

以琼脂糖凝胶(Sepharose)CL-6B为载体,衍生化的氟虫腈为亲和配基,制备亲和层析介质,对其进行FT-IR和XPS表征。用制备的亲和层析介质分离鱼类脑组织中的GABA(γ-氨基丁酸)受体,研究分离蛋白质的效率。结果表明,成功将氟虫腈作为配体偶联到亲和介质上,偶联量为36.68μmol/g胶;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示两条蛋白质条带,其相对分子质量约为44 kD和55 kD。     

静电耦合亲和层析纯化人血清白蛋白的研究

人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是人血清中含量最丰富的蛋白，约占血清总蛋白含量的40%～60%。商品化的白蛋白亲和介质(Cibacron Blue F3GA)的配基毒性大、易脱落、载量低，纯化白蛋白回收率较低。本研究制备了一种新型静电耦合亲和介质(DASA-Sepharose,3,5-Diaminobenzoic Acid n-Octyl Succinic Anhydride-Sepharose)，并通过一步层析从人血清中高效纯化白蛋白。DASA-Sepharose介质采用3,5-二氨基苯甲酸间隔臂将正辛基琥珀酸酐亲和配体偶联于琼脂糖微球。DASA-Sepharose间隔臂上的羧基通过静电作用吸附白蛋白，进而与正辛基琥珀酸酐亲和配基协同作用实现静电耦合亲和吸附，在保持亲和吸附高特异性的同时大大提高了吸附载量。采用牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)为模型蛋白考察了Na Cl浓度和溶液pH对介质静态吸附载量(Q_m)的影响，NaCl浓度为0.025～0.06 mol/L时Q_m几乎不受影响，...     

超大孔聚苯乙烯微球固定蛋白质

采用琼脂糖对孔径为300~500 nm的超大孔聚苯乙烯(MPS)微球进行亲水化修饰,并在修饰后的表面上偶联病毒蛋白颗粒(RV),用于蛋白质的分离纯化实验. 结果表明,经过修饰的MPS层析介质具有优异的流体力学性能,层析过程的最高流速可达1120 cm/h,对病毒蛋白颗粒的固定量为0.638 mg/g,是商品化介质Sepharose 4FF的2倍. 采用RV-MPS介质对病毒蛋白颗粒抗体进行了分离纯化,收率为29.22%,高于Sepharose 4FF的18.92%.     

新型耐碱蛋白A介质的制备与性能

以蛋白A结构中耐碱性更好的C区为基础，构建一种新型耐碱蛋白A，并偶联至琼脂糖基质，获得新型耐碱蛋白A亲和层析介质，分别用激光共聚焦显微镜和石英晶体微天平研究了人免疫球蛋白(hIgG)与蛋白A介质的结合过程。结果表明，该介质具有较商品配基更高的结合力和稳定的再生性能，hIgG动态载量达62.0 mg/mL，40次再生操作后载量为初始载量的84%。该介质在抗体纯化领域具有较好的应用前景。     

血液净化用内毒素亲和吸附剂的制备研究

采用高碘酸钠法,以琼脂糖凝胶微球为载体,多粘菌素B(Polymyxin B,PMB)为配基,合成了血液净化用内毒素吸附剂,探讨了高碘酸钠的反应浓度、反应时间、反应温度对载体活化的影响,以及PMB的反应浓度、反应时间对偶联的影响,并对最优条件下合成的高分子吸附剂进行血浆中细菌内毒素的亲和性能评价。结果表明:琼脂糖活化时Na IO4的浓度为0.2 M、反应时间为4 h、反应温度为37℃时醛基含量达到最高值112.0μmol/g;配基偶联时PMB浓度为20 mg/mL、反应时间为4 h时配基偶联量达到最高值17.5 mg/g,静态吸附实验表明每毫升吸附剂填料对血浆中内毒素的吸附容量为71.7 EU,清除率为71.7%,表明该最优条件下合成出的吸附剂对血浆中细菌内毒素具有高选择性,高吸附容量。     

超大孔微球固定木瓜蛋白酶制备酵母抗氧化肽

文中选用新型超大孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球偶联木瓜蛋白酶,用于催化酵母蛋白水解制备抗氧化肽。木瓜蛋白酶在微球上负载量为66.5 mg/g,并且均匀分布于微球内外表面;固定化酶比活力为137.5 U/mg,活力回收率达60.6%,高于商品化介孔微球固定化酶的活力。在固定化木瓜蛋白酶的可控催化作用下,酵母蛋白水解产物的最高抗氧化活力为81.2 mol TE/g,远高于蔬果的抗氧化活力。此外,固定化木瓜蛋白酶重复使用20次后仍剩余35%的初始活力。     

肝素-琼脂糖凝胶6FF的制备及其在抗凝血酶III分离纯化中的应用

以自制琼脂糖凝胶6FF为基质,肝素为配基,利用还原胺化方法制备了肝素-琼脂糖凝胶6FF介质. 考察了肝素偶联反应的影响因素,并对其进行了优化,得到肝素配基的含量为2.7 mg/mL. 用所制介质从人血浆中分离出抗凝血酶III,从血浆开始计算的抗凝血酶III活性回收率为31.76%,与商品Heparin-Sepharose CL-6B的分离效果相当.     

肝素-琼脂糖凝胶6FF的制备及其在抗凝血酶III分离纯化中的应用

以自制琼脂糖凝胶6FF为基质，肝素为配基，利用还原胺化方法制备了肝素-琼脂糖凝胶6FF介质. 考察了肝素偶联反应的影响因素，并对其进行了优化，得到肝素配基的含量为2.7 mg/mL. 用所制介质从人血浆中分离出抗凝血酶III，从血浆开始计算的抗凝血酶III活性回收率为31.76%，与商品Heparin-Sepharose CL-6B的分离效果相当.     

混合模式介质的制备及用于清除抗体中蛋白A

针对抗体纯化过程中脱落蛋白A的清除,设计和制备了以N-苄基-N-甲基乙醇胺为功能配基的混合模式层析介质Adhere NUPharose FF,该配基兼有疏水、静电和氢键作用。采用烯丙基缩水甘油醚活化法,并对琼脂糖微球基质的活化和配基偶联条件进行了优化,优化后活化密度达260μmol·ml~(-1)以上,配基密度达120μmol·ml~(-1)。同时以抗体和蛋白A的混合物为研究对象来考察该介质对抗体中蛋白A的清除能力,结果表明对蛋白A的有效去除率达到83.1%,为抗体制品中蛋白A的清除提供了一种可行性方法。     

Cu~(2+)-IDA金属螯合尼龙-壳聚糖复合膜的制备及其亲和分离性能研究

为获得既具有良好机械强度和化学稳定性又具有大量活性官能团的金属螯合亲和膜介质,以尼龙膜为基膜,采用环氧氯丙烷活化共价偶联壳聚糖,制备尼龙-壳聚糖复合膜,膜上偶联壳聚糖的含量达98.2 mg·(g膜)-1,为配基的固载提供了大量活性位点.再次采用环氧氯丙烷活化复合膜,进而偶联亚氨二乙酸(IDA)、固定化Cu2+,获得金属螯合尼龙-壳聚糖复合型亲和膜,配基Cu2+固载量为5.4μmo1·cm-2.以牛血清白蛋白为目标蛋白,考察亲和膜的分离性能.研究结果表明:牛血清白蛋白在膜上的吸附行为符合Langmuir吸附等温方程,膜对牛血清白蛋白具有较好的亲和吸附效果,吸附容量达1.09 mg·cm-2.该膜具有较长的使用寿命并且容易再生.     

断裂内含肽介导的亲和介质与亲和标签的应用

应用Cfa断裂内含肽构建了一种新型的亲和纯化系统,并完成对目的蛋白无标签纯化。首先对Cfa断裂内含肽的IN片段与IC片段进行分子改造,通过研究在自由混合条件下的断裂情况,测定了其断裂速率。其次以改造后的IN片段作为配体与环氧活化的琼脂糖微球载体偶联,制备了IN亲和层析介质;IC片段作为亲和标签与目的蛋白GFP融合,并利用IN亲和层析介质实现对目的蛋白进行无标签纯化。结果表明,将IN与IC-GFP片段混合后,30s内即可断裂超过50%,4 h内即可完全断裂;IN亲和层析介质的静态载量为66.78 mg×m L~(-1),动态吸附载量约为30 mg×m L~(-1);纯化后的绿色荧光蛋白(GFP)纯度达到了96.7%,回收率为29.3%。Cfa断裂内含肽的应用为开发新型亲和纯化技术提供了一种潜在的方法。     

药物偶联亲和高分子微球对牛血蛋白吸附性能研究

在制备亲和高分子乳液微球基础上,对其进行空间臂改性和药物分子偶联制得PSGN-MTA亲和高分子微球药物。为研究亲和高分子微球生物相容性,考察了高分子微球药物在缓冲液中药物释放行为及对BSA蛋白吸附能力。结果表明,亲和微球表面化学键合MTA药物浓度较高且分布均匀时,对BSA蛋白的吸附过程较符合一级动力学方程。还考察了pH值对BSA蛋白吸附的影响,中性条件时PSGN-MTA微球对于BSA吸附效果较好。     

葡聚糖接枝型耐碱Protein A介质的层析性能提升研究

Sepharose 4FF微球经环氧活化后与葡聚糖溶液反应,得葡聚糖接枝型琼脂糖微球,再经环氧活化和偶联耐碱型Protein A配基,得葡聚糖接枝型高载量Protein A介质,测定了介质在线清洗稳定性能,并进行了热力学研究. 结果表明,与常规Protein A介质相比,葡聚糖接枝型Protein A介质的最高流速提高约32%,对抗体hIgG的动态载量为60.6 mg/mL,分别为常规介质和MabSelect SuRe介质载量的123%和95%;经40次清洗后,葡聚糖接枝型Protein A介质动态载量为原始载量的92%,远高于常规介质的84%,与MabSelect SuRe稳定性基本一致. 3种介质对抗体的结合均为熵驱动过程,葡聚糖接枝型Protein A介质的吸附热介于MabSelect SuRe和常规Protein A介质之间.     

葡聚糖接枝型Protein A介质的层析性能提升

Sepharose 4FF微球经环氧活化后与葡聚糖溶液反应,得葡聚糖接枝型琼脂糖微球,再经环氧活化和偶联耐碱型Protein A配基,得葡聚糖接枝型高载量Protein A介质,测定了介质在线清洗稳定性能,并进行了热力学研究.结果表明,与常规Protein A介质相比,葡聚糖接枝型Protein A介质的最高流速提高约32%,对抗体h Ig G的动态载量为60.6 mg/m L,分别为常规介质和Mab Select Su Re介质载量的123%和95%;经40次清洗后,葡聚糖接枝型Protein A介质动态载量为原始载量的92%,远高于常规介质的84%,与Mab Select Su Re稳定性基本一致.3种介质对抗体的结合均为熵驱动过程,葡聚糖接枝型Protein A介质的吸附热介于Mab Select Su Re和常规Protein A介质之间.     

相分离联合层析去除类人胶原蛋白中的内毒素

研究类人胶原蛋白(HLC)中内毒素的去除方法,为规模化制备医用生物材料提供参考。采用Triton X-114双水相分离法作为内毒素去除工艺的第1步,亲和层析法作为工艺的第2步,二者偶联操作从类人胶原蛋白中除去内毒素,并对除去内毒素后的HLC进行了理化性能检测。结果表明:采用Triton X-114双水相分离法,在蛋白质量浓度2.06 mg/m L,作用温度44.71℃,作用时间3 h,溶液pH值为7时双水相分离系数K=9.58,蛋白中内毒素含量由10 000—25 000 EU/mg下降为1.5—2.0 EU/mg,蛋白回收率为95.6%;偶联了多聚赖氨酸亲和配基的亲和层析后,HLC中内毒素含量由1.5—2.0 EU/mg降至0.025—0.25 EU/mg,蛋白回收率可达81.9%;2步操作均不会使蛋白发生相对分子质量及化学结构的改变。此工艺操作简便,可显著降低生产成本。     

十字型微通道制备粒径均一的纤维素层析介质

为了满足层析介质对粒径单分散的要求,利用十字型微通道的聚焦效应,形成粒径均一的纤维素微液滴,经固化成纤维素微球,再偶联配基制成了纤维素层析介质。以离子液体1-乙基-3-甲基咪唑甲基磷酸直接溶解微晶纤维素为水相,葵花籽油为油相,考察了微通道内微液滴的形成条件,优化了纤维素浓度、分散剂浓度、油水两相流速等因素,得到粒径约100 μm的纤维素微液滴,CV值小于0.2。微液滴固化再生,得到球形度良好的纤维素微球,湿真密度1.019 g·ml^-1,孔度94.6%,体均粒径105.5 μm;进一步偶联DEAE配基,制得了离子交换层析介质,离子交换容量为123.3 μmol·g^-1,牛血清白蛋白的饱和吸附容量Q_m达到220 mg·g^-1,有效扩散系数D_e为1.8×10^-11m²·s^-1,体现出较好的蛋白质吸附性能。     

亲和层析介质上蛋白质偶联位点的控制方法

以溶菌酶为模型蛋白,将其偶联在环氧活化的琼脂糖介质上,采用液质联用技术结合蛋白质酶切技术对琼脂糖介质表面配基蛋白的偶联位点进行了识别,考察了活化时间、偶联时间和溶液pH值对偶联位点的影响. 结果表明,环氧基密度为11.34 mmol/g、反应pH 9.5条件下,溶菌酶偶联位点发生在K96,延长偶联反应时间蛋白配基偶联量增加,对偶联位点种类无显著影响;增加环氧基密度或提高偶联反应pH值使溶菌酶通过多种位点偶联,在pH≥10.5条件下偶联位点主要发生在K33, K96和K97.     

氧化锌为模板制备中空二氧化硅微球及其对聚丙烯酸酯薄膜性能的影响

以氧化锌为模板,在超声作用及表面活性剂的辅助作用下正硅酸乙酯原位水解制备核/壳型氧化锌/二氧化硅复合微球,然后在盐酸溶液中溶解氧化锌核制备中空二氧化硅微球,采用红外光谱仪(FTIR)和透射扫描电子显微镜(TEM)表征其结构和形貌。最后,将中空二氧化硅微球应用于聚丙烯酸酯薄膜中考察其透水汽性和力学性能。结果表明,采用Tween-80和聚乙烯吡咯烷酮为表面活性剂可有效分散氧化锌,且有利于二氧化硅包覆在其表面,从而成功获得核/壳型氧化锌/二氧化硅复合微球。同时,采用盐酸作为刻蚀剂,在pH=2.0的条件下,可有效刻蚀氧化锌,获得中空二氧化硅微球。FTIR表明形成了中空二氧化硅,中空二氧化硅微球的壳层内部附有一层未被刻蚀的氧化锌。TEM表明,该中空二氧化硅微球粒径为47nm左右,其壳层厚度为12nm,空腔直径为23nm。将制备的中空二氧化硅微球引入到聚丙烯酸酯薄膜中,该中空二氧化硅微球可显著改善聚丙烯酸酯薄膜的透水汽性能和力学性能。当中空二氧化硅微球的质量分数为1.5%时,聚丙烯酸酯薄膜的透水汽性能达到最佳。