枯草芽孢杆菌克隆与表达微小毛霉凝乳酶基因

从自制的酒酿利用酪蛋白培养基分离纯化到了一株产凝乳酶的微小毛霉菌株（ZZMZ-19）,从ZZM-19菌株的cDNA文库筛选到了两个凝乳酶基因chl和ch2并实现了凝乳酶基因ch1和ch2在枯草芽孢杆菌菌株（ZZMZ-01）中的的克隆与表达。chl和曲2阳性克隆菌株在酪蛋白培养基r1]发酵30h左右的时间凝乳酶酶活达到最人,分别为48．27SU／mL和41．02SU／mL,相比出发菌株发酵时间缩短了15h。用交联葡聚糖凝胶柱G100分离纯化其发酵卜清液后,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测得CHII和cHIII分子草分别为32ku和30ku。     

枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的生物信息学分析

该研究应用生物信息学方法对枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA进行分析,旨在为LipA的后续研究奠定一定的理论基础。采用一系列在线网站或软件对LipA的一级结构、亲疏水性、基本特性、二级结构、特殊卷曲螺旋、模体以及富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、丝氨酸（S）和苏氨酸（T）的PEST序列等进行预测和分析,并对三级结构进行同源建模,对其表面电位、可及性分布以及Ramachandran图等进行分析。枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA是一种由212个氨基酸组成的稳定的脂溶性蛋白质,其亲、疏水性最强的区域分别为Lys75~Asn81和Val9~Leu17;不存在稳定的二聚体、三聚体卷曲螺旋和非PEST序列;有3种可能参与不同的生化反应的模体;有5段α-螺旋、6段β-折叠的α/β类蛋白;整体呈弱正电势;LipA的可及性和Ramachandran图表明建模得到的三维结构是合理、可靠的。该研究为后续对枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的分子设计和改造提供了一定的理论基础。     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达

以纳豆芽孢杆菌HL-1全基因组DNA为模板,PCR分别扩增编码信号肽、前导肽及成熟肽的前纳豆激酶原基因序列(pre-pro-NK),编码前导肽、成熟肽的纳豆激酶原基因序列(pro-NK)和只编码成熟肽的纳豆激酶基因序列(NK),构建了大肠杆菌表达质粒pET28a-NK表达前纳豆激酶原基因及大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pHT315-NK表达纳豆激酶原基因和纳豆激酶基因,实现了纳豆激酶基因在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌中的表达,并进行了活性分析。     

耐热β-半乳糖苷酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆和表达

用PCR的方法从嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilis ATCC8005)染色体DNA中扩增到耐热β- 半乳糖苷酶基因bgaB,装载到大肠-枯草穿梭质粒pZZ01中,并将其转化到枯草杆菌宿主WB600中进行表达。在1%的淀粉培养基上摇瓶培养,36h时酶活达到24U/mL,和大肠杆菌pET系统相当。同时产酶出现了2个增长时期,第1阶段在对数生长期,第2阶段在静止期,这和重叠启动子P43的性质是相吻合的。     

枯草芽孢杆菌胺氧化酶基因的克隆与表达

以细菌型豆豉工业发酵菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ3-2为材料,根据NCBI中菌株B. subtilis 168的胺氧化酶（AMO）基因序列设计同源引物,克隆获得菌株B. subtilis BJ3-2的胺氧化酶基因YobN序列。测序结果显示,YobN基因开放阅读框（ORF）长为1 437 bp,编码478个氨基酸,分子质量为53.79 ku,与菌株B. subtilis 168同源性达98%。目的基因克隆至原核表达载体,获得重组菌pET28a-YobN/BL21,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示,浓度为1.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）22 ℃诱导5 h,表达量最高达1.30 mg/mL。该研究为AMO活性的研究奠定了基础,对豆类发酵食品中生物胺的控制具有重要意义。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

脲酶基因挖掘及其在枯草芽孢杆菌中的重组表达

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate,简称EC）是一种存在于黄酒中的潜在致癌物,酶法降解EC及其前体物质尿素因此备受关注。该研究通过基因挖掘获得了解淀粉芽孢杆菌IT-45的脲酶（Ba-urease）基因并在食品级系统枯草芽孢杆菌中实现了表达与应用。通过密码子优化、核糖体结合位点优化重构脲酶基因簇后,酶活力从6.85 U/mL提升至9.01 U/mL;通过调整基因ureC的位置,脲酶活力进一步提升至10.15 U/mL。研究发现,重组脲酶的最适反应温度为37 ℃;最适反应pH范围为6.5~7.0,为中性脲酶。摇瓶发酵的最佳培养条件为：TB培养基、接种体积分数5%、诱导温度28 ℃、Ni²⁺添加量4 mmol/L。在最佳发酵条件下,酶活力达到12.5 U/mL,在酶法降解黄酒中的尿素具有应用前景。     

带自身启动子的bgaB基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的启动子连同β-半乳糖苷酶bgaB基因经PCR扩增后,连接在T载体上,再取代枯草杆菌载体pZ01-bgaB的启动子,将其在枯草杆菌宿主WB600中表达.经摇瓶发酵20h,得到乳糖酶活力6.37U/mL,比活力3.814U/mg,SDS-PAGE电泳显示有明显重组蛋白质条带.证明了嗜热脂肪芽孢杆菌来源的启动子在枯草杆菌中是完全适用的.     

酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

酸性α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现酸性α-淀粉酶基因的高效表达,将本实验室已经克隆得到的去信号肽的酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌WB600宿主中进行表达,成功的构建了表达菌株pHT43-amy/WB600。在初始菌浓度OD600为0.8时加入终浓度为0.9 mmol/L的IPTG,诱导6 h的条件下测得酶活力为1 230 U/mL,又由于宿主菌WB600外分泌蛋白较少,因此具有明显的生产优势。     

重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

普鲁兰酶可特异性地水解支链淀粉得到直链淀粉,因而在淀粉加工过程中具有重要的应用。本研究从Bacillus naganoensis ATCC53909基因组中克隆了普鲁兰酶基因pul,并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体p BE中,构建表达载体p BE-pul。在此基础上,将来源于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌中的17个高表达基因的启动子分别克隆到表达载体p BE-pul中,并转化至Bacillus subtilis ATCC6051?10,成功构建了十七株含有不同启动子介导普鲁兰酶分泌表达的重组菌株。对重组菌株的分泌表达比较发现,启动子P43和Pspov G介导的普鲁兰酶活性明显优于其他启动子,其中Pspov G介导的普鲁兰酶活性更高。同时,还使用了启动子Pspov G介导N端的108个氨基酸缺失的pul324突变体进行分泌表达。通过对17种启动子的比较和两个普鲁兰酶基因的比较,本研究构建的一株重组菌株的普鲁兰酶的表达更为高效,其活性高达389.85 U/mL,后者显著高于现有的相关报道。     

重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌构建与表达

根据GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR克隆α-淀粉酶基因(amy),将α-淀粉酶基因插入穿梭表达载体pP43C,构建重组质粒pP43Camy。随后将重组质粒转化八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌WB800,经筛选获得重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌WB800/pP43Camy1026,工程菌摇瓶发酵酶活力达960U。性质研究表明,重组α-淀粉酶的最适作用温度为70℃,最适反应pH为6.0,具有良好的应用潜力。     

脂肪酶的基因克隆、序列分析、高效表达及其催化特性

分别以R. miehei 3.4960基因组和总RNA为模板,通过PCR和RT-PCR扩增得到脂肪酶全长基因和脂肪酶cDNA碱基序列,两碱基序列测序结果比对表明：脂肪酶DNA碱基序列由5个内含子和6个外显子组成,5个内含子大小分别为75、58、64、73、59bp,位于DNA序列(以起始密码子ATG的碱基A为1)的600～674位、929～986位、1076～1139位、1227～1299位、1382～1440位碱基处。脂肪酶RML mRNA碱基序列与已公布的R. miehei脂肪酶基因mRNA(EMBL Nucleotide Sequence Database Accession No. A02536)碱基序列有5个碱基的差异,其编码的氨基酸序列有1个发生了改变。利用酿酒酵母表达质粒pICAS1,实现了脂肪酶RML基因在酿酒酵母中的高效分泌表达,并对重组脂肪酶RML进行了相关酶学性质分析。酶学性质研究表明：重组酶的最适反应温度为45℃,最适pH值为8.6;该酶偏爱中链长的酯(C8～C12),对12个碳的酯具有最佳活性,对C16长链酯也有较高的活性,对短链酯的活性较弱;金属离子Cu2+、Fe2+对酶活性有显著抑制作用,Ca2+和Mg2+对酶活有部激活作用。     

耐热β-半乳糖苷酶基因bgaB在枯草芽孢杆菌中的整合表达

来源于嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillusstearothermophilus的耐热β 半乳糖苷酶基因bgaB被克隆到大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒pMA5中,然后将外源基因及其表达调控序列亚克隆到枯草芽胞杆菌整合载体pSAS144中,转化Bacillussubtilis受体菌BD170,在5μg/mL的氯霉素抗性平板上筛选抗性转化子.经摇瓶发酵后,得到耐热乳糖酶的比酶活为0.32U/mg,是出发菌株比酶活的2倍.     

枯草芽孢杆菌QM11漆酶基因克隆表达及序列分析

为获得高效表达的产漆酶工程菌,将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的漆酶（cotA）基因在大肠杆菌中表达。用PCR的方法从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）QM11基因组中扩增cotA基因,连接载体pET22b构建成表达载体pET22b-cotA,转化至E.coli BL21（DE3）进行诱导表达,最终通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况。克隆得到的cotA基因含有1542个核苷酸,由513个氨基酸组成,预测相对分子量为58 ku,理论等电点为5.91,无信号肽,二级结构以β-折叠和无规卷曲为主,其中β-折叠占26.71%,无规卷曲占52.05%,与NCBI已公布的Bacillus subtilis漆酶cotA基因（Gen Bank:GQ184294.1）碱基序列有12个碱基的差异,其编码的氨基酸序列有4个发生了改变。通过SDS-PAGE检测,目标蛋白相对分子质量约为54 ku,与预测相对分子量基本相符。      

圆弧青霉BD26碱性脂肪酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以圆弧青霉BD26总RNA为模板,扩增出774 bp cDNA片段,将该基因片段克隆到表达载体pET-28a(+)上并转化Escherichia coil BL21(DE3),得到重组菌株BL21/ Lip PD。经IPTG诱导,菌体在固体琼脂显色平板上形成明显透明圈。SDS-PAGE电泳显示该脂肪酶分子质量约为27 ku。表达条件优化结果表明,当工程菌培养至OD_(600)为0.5时,加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L,在32℃诱导培养1 h,比酶活达29.30 U/mg。     

碱性芽孢杆菌木聚糖酶基因的克隆及表达

本实验从广西红树林土壤中筛选出一株产木聚糖酶的耐碱菌HSL38,经过16S rDNA鉴定,其与碱性芽孢杆菌Bacillus halodurans C-125(GenBank：NC_002570.2)的同源性达到99%。参考Bacillus halodurans C-125的β-1,4-木聚糖酶基因xynA设计引物,扩增出HSL38中的β-1,4-木聚糖酶基因xyl-BH-G10,其与xynA的同源性达到99%,编码396个氨基酸残基(45.27kD),属于糖基水解酶GH10家族。将xyl-BH-G10基因与表达载体pET-30a-c(+)连接,构建重组载体,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白。结果表明,在最佳诱导条件下,木聚糖酶基因xyl-BH-G10在大肠杆菌细胞内高效表达,酶活力达到55.28U/mL,是原菌株HSL38发酵液酶活力的4倍。     

圆弧青霉脂肪酶基因的克隆和表达

圆弧青霉PG37总RNA甲醛变性电泳呈现真核生物所特有的 2 8SrRNA和 18SrRNA条带 .根据PG37所产碱性脂肪酶 (LipPC)N末端氨基酸残基序列和真核生物mRNA在 3’端具有poly(A)等所提供的生物信息 ,采用RT PCR技术扩增了LipPC成熟肽和 3’非编码区的cDNA片段 ,并将该PCR产物直接克隆至pUCm T载体中 .序列分析表明 ,LipPC含有 2 5 8个氨基酸残基 ,其中保守的五肽序列为Gly His Ser Leu Gly .进一步采用ClonTech公司的SmartTM PCRcDNA文库构建试剂盒 ,扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段 ,从而完成了LipPC完整cDNA的分析测定 .最后将编码完整脂肪酶蛋白质的cDNA克隆至 pGEX 5X 3表达载体中 ,SDS PAGE检测结果表明 ,大肠杆菌BL2 1所表达的GST LipPC融合蛋白质分子质量约为 5 3ku .     

耐酸Bacillus velezensis P7木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达及优化

为获得适应于酒糟酸性环境的木聚糖酶,将内源微生物耐酸性环境的野生Bacillus velezensis P7木聚糖酶基因克隆到枯草芽孢杆菌WB800中,纯化后通过SDS-PAGE电泳显示出约40 ku的蛋白多肽。为增加枯草芽孢WB800-P7工程菌株在高密度发酵中细胞外分泌木聚糖酶的产量,进行诱导和培养条件优化,用正交试验分析得出温度对产酶影响最大,确定菌株分泌重组蛋白的条件结果表明：最佳诱导条件为OD600 0.8、IPTG 1.2 mmol/L,最佳发酵条件为pH 6.0、培养温度35 ℃、接种量2%、摇床转速160 r/min。在该条件下发酵16 h,经重复验证,酶活力达到4.21 IU,与优化前相比,酶活力提高了64.45%。并探究重组酶的耐受性,结果表明在强酸性到中性条件下（pH 5.0~7.0）,其残余酶活力达到初始酶活力的80%以上。试验成功构建了木聚糖酶工程菌并较好表达蛋白,且重组木聚糖酶在酸性条件的耐受性良好。