短乳杆菌和植物乳杆菌产γ-氨基丁酸及其关键基因的研究

为研究乳杆菌γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的产量以及其与谷氨酸脱羧酶系统关键基因表达的相关性,实验结合GABA产量、基因组学调查和谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)系统基因的扩增结果,发现产GABA的菌株在短乳杆菌、植物乳杆菌中分布较多,这2个种属可作为产GABA菌株的主要筛选对象。通过qRT-PCR研究短乳杆菌和植物乳杆菌不同生长时期GAD相关基因转录情况,结果表明,短乳杆菌的gad B和gad C的表达量变化情况相似,且在对数后期或稳定前期达到高峰。文中的短乳杆菌高产GABA可能与其gad C和gad B的高表达有关。植物乳杆菌的gad B表达变化与短乳杆菌类似,但是与GABA的产量之间相关性较弱,可能存在其他因素的影响。该研究为产GABA菌株的筛选,乳杆菌中GAD基因的表达调控,GABA发酵工艺的优化提供了理论基础。     

富含γ-氨基丁酸酸奶的制备及质构特性研究

本试验对单菌发酵、混菌发酵和添加不同底物浓度的L-谷氨酸钠对酸奶感官特性和质构特性的影响作用进行了研究,为开发富含γ-氨基丁酸的新型功能发酵乳制品提供依据。试验结果表明,当底物L-谷氨酸钠的添加浓度为75mmol/L,辅酶浓度为20μmol/L,植物乳杆菌NDC75017、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌3株菌混合（L.P∶L.b∶S.t=0.5∶0.5∶1.5）按2%的比例添加量,在43℃条件下发酵酸奶时,酸奶的感官特性和质构特性最好。此时酸奶的粘度为1 466.5±1.0p·s、保水力为71.7±3.2%、硬度为77.3±1.7g、凝聚性为48.1±1.2g、粘性指数为146.8±0.9p·s;用高效液相色谱法检测酸奶中GABA的含量高达46mg/100g。综合酸奶口感、质构特性及GABA含量等指标,最终选择添加底物L-谷氨酸钠的浓度为75mmol/L,植物乳杆菌NDC75017、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌3株菌作为酸奶发酵的混合发酵剂。     

产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离鉴定及发酵条件优化

从四川泡菜水中分离筛选出一株产γ-氨基丁酸(GABA)能力较强的乳酸菌W1-9,根据菌落和个体形态、生理生化指标及16S r DNA序列的系统鉴定,菌株W1-9为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。菌株W1-9在含10 g/L谷氨酸(Glu)的MRS培养基中培养3 d,可产生2.18 g/L GABA。通过对菌株发酵培养基及发酵条件优化,结果表明:以黄瓜汁为发酵培养基,初始p H 5.5,底物谷氨酸钠(MSG)添加量12 g/L,菌液接种量1.2%,在该条件下GABA产量达到7.62 g/L。     

谷氨酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的表达及应用

为了研究在枯草芽孢杆菌发酵过程中添加相对廉价的辅酶前体对谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活力和催化效率的影响,将来源于Escherichia coli的谷氨酸脱羧酶基因gadB,通过构建重组质粒p HY300PLK-gadB,在枯草芽孢杆菌中重组表达,得到重组菌B. subtilis/pHY300PLKgadB。研究了分别在重组菌发酵过程中添加辅酶磷酸吡哆醛(PLP)、辅酶前体吡哆醛(PL)和吡哆醇(PN)对GAD酶活力的影响。当设置摇床转速200 r/min,发酵温度33℃,发酵培养基初始p H 7.0时,在发酵过程中分别添加PLP、PL、PN至终浓度0.5 mmol/L,诱导48 h后发酵液中总酶活分别达到25.40、28.14、15.55 U/mL,是对照总酶活的1.55、1.72、0.95倍。基于以上结果,进一步研究了发酵过程中PL的添加浓度对重组菌生长情况及GAD表达的影响。结果表明,发酵液中GAD总酶活随着PL浓度的增加而增加,当PL浓度为0.1 mmol/L时,总酶活最高达到28.28 U/mL。利用重组菌全细胞制备γ-氨基丁酸(GABA),结果表明,最适转化pH为5.0,最适转化温度为40℃,发酵过程中添加PL的重组菌(简称"GAD-PL")和发酵过程中不添加任何辅酶及辅酶前体的重组菌(简称"GAD-0")的最适加菌量(以酶活力单位计)分别是40 U/g(以谷氨酸计)和50 U/g(以谷氨酸计),当谷氨酸最终质量浓度达到400 g/L时,得到的GABA质量浓度分别为275.60 g/L和273.61 g/L。     

重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成γ-氨基丁酸条件的优化

研究重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的适宜条件。检测温度、p H值、表面活性剂、金属离子、底物与菌体质量比以及反应体系体积对GABA转化效率的影响。结果表明:最优转化条件为:转化体系5 m L、底物L-谷氨酸钠浓度0.1 mol/L、重组大肠杆菌细胞6.4 mg(干质量)、Triton-100体积分数0.06%、Ca2+浓度0.6 mmol/L,转化温度45℃、反应体系p H 4.5。在该体系下反应7 h,GABA合成量达到26.1 g/L,GABA转化效率在1 h时达到最高,为13.8 g/(g h),较优化前提高1.5 倍。     

短乳杆菌GLB-127发酵制备γ-氨基丁酸

短乳杆菌(Lactobacillus brevis)为国家卫健委批准用于制备γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)的微生物菌种。利用短乳杆菌发酵表达谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD),将GAD全细胞用于催化L-谷氨酸生产GABA的研究具有重要意义。采用扫描电子显微镜与分子生物学手段鉴定了1株短乳杆菌GLB-127,构建了该乳酸菌的系统发育树。通过优化发酵及转化条件,包括培养转速、培养温度及全细胞催化酶加量等条件,初步确定了短乳杆菌制备GABA的工艺;然后又对发酵培养基进行了优化,使得GAD活力及GABA产量有了明显提升。经10 L发酵罐放大培养,GABA质量浓度达到了345.1 g/L,转化率为98.5%,GAD活力达315.9 U/g。该研究为新食品原料GABA的工业化生产奠定了基础。     

高产γ-氨基丁酸的富锌乳酸菌培养基优化及GAD基因的克隆和序列分析

为了检测和提高乳酸菌γ- 氨基丁酸(GABA)产量,本研究采用纸层析预染法分析Lactobacillus brevis BS2最佳发酵产GABA 条件为：pH5.0,以葡萄糖为碳源,以大豆蛋白胨和牛肉膏为复合氮源,碳氮比为1:1,底物质量分数1%,GABA 产量可达到6.32g/L。采用CTAB 法提取该菌株基因组,并以此基因组为模板应用降落PCR扩增出1407bp 的谷氨酸脱羧酶基因gad,将gad 克隆到T 载体后经测序分析发现与L. brevis strain BH2 的gad 具有高度的同源性,同源性达98%,证明该菌株为高产GABA 的富锌短小乳酸杆菌,在工业应用方面具有很大潜力。     

732阳离子交换树脂对全细胞谷氨酸脱羧酶活性的促进机制

通过对全细胞和纯酶的对比分析,从732阳离子交换树脂对细胞转化体系pH、产物效应和底物效应的影响,对732阳离子交换树脂促进屎肠球菌全细胞谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD,EC4.1.1.15)活力的机制进行了探讨。结果显示:γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)对全细胞GAD活性具有抑制作用,而L-谷氨酸(L-glutamic acid,L-Glu)却无此现象,并且当L-Glu浓度达到200 mmol/L以上时,全细胞GAD活性才达到最大;在pH4.2~5.8条件下,GABA解离为阳离子较L-Glu多,可与树脂平衡时所结合的L-Glu和H+发生离子交换,补充游离L-Glu,减少游离GABA,稳定反应体系pH。研究表明,732阳离子交换树脂可以通过离子交换作用而释放H+、L-Glu和结合GABA,增加反应液游离底物浓度和降低游离产物浓度,并调节反应液pH,增大细胞内外浓度差,加快细胞内外物质运送速度,从而提高全细胞GAD的表观活力。     

响应面法优化采后生防菌梅奇酵母培养条件

为优化梅奇酵母的培养条件,研究不同温度、初始p H值和接种量对梅奇酵母生物量的影响。通过中心复合试验设计,构建3因素(温度、初始p H、接种量)5水平的响应面设计方法,建立梅奇酵母生长的活菌数与3因素的二次回归数学模型。结果表明:3因素对梅奇酵母的生长均有显著影响(P0.01),影响的顺序为温度初始p H值接种量;初始p H值与接种量之间存在显著的交互作用(P0.01),温度与初始p H值、接种量之间的相互作用对梅奇酵母生长的影响不显著(P0.05);多元二次回归分析结果显示,温度、初始p H值、接种量与梅奇酵母菌生物量之间的回归模型高度显著(P0.01)。统计分析确定梅奇酵母的最佳摇瓶培养条件为:温度26.1℃、初始p H 5.6、接种量1.2%。在此条件下,梅奇酵母活菌数的对数预测值为9.3912,验证试验所测浓度为2.56×109CFU/m L,换算为lg对数即为9.408,与模型相比,误差为0.19%。     

以油茶籽粕为底物发酵生产蛋白酶培养条件的优化研究

优化了枯草芽孢杆菌KD-N2利用茶籽粕等为底物液体发酵生产蛋白酶的发酵条件。单因素实验结果表明,在初始p H 8.0、种龄30h、转速230r/min、接种量12%(v/v)、培养温度28℃、装液量30m L时,发酵液中蛋白酶活性较高。正交试验结果表明,接种量5%(v/v),装液量30m L,初始p H值7.2时为最佳条件,在30℃、30h种龄、200r/min培养18h后蛋白酶活性达到104.2U。文章同时对发酵过程可溶性蛋白质含量和发酵液p H值变化进行了分析,为提高发酵产酶总量,发酵条件还需进一步进行优化。     

植物乳杆菌NDC75017抗氧化活性研究

目的：研究酸奶中所筛选的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）NDC75017在不同体系中的抗氧化作用模式。方法：测定了活细胞、无细胞提取物、胞外分泌物及菌体灭活物质的自由基清除能力、总抗氧化能力（totalantioxidant capacity,T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase,T-SOD）活性、还原能力和金属离子螯合能力。结果：株菌能够耐受一定浓度的过氧化氢（H2O2）,无细胞提取物的超氧阴离子自由基（O2－•）和DPPH自由基清除能力最强,胞外分泌物的羟自由基（•OH）清除作用最好。无细胞提取物和胞外分泌物的T-AOC效果最佳,与另外两组差异显著（P＜0.05）。胞外分泌物的GSH-Px和T-SOD酶活性最高,明显比无细胞提取物和菌体灭活组效果好（P＜0.05）。4 组样品都具有还原能力和金属离子螯合能力,但Cu2+螯合能力不如Fe2+螯合能力效果好。结论：菌株具有抗氧化活性,其抗氧化本质可能与其具有金属离子螯合能力、提供电子和清除自由基等作用模式有关。     

活性化糙米富集γ-氨基丁酸的雾化液组分优化

通过单因素试验和正交试验,优化了糙米湿润活性化富集γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的雾化液p H值、VB6及Ca Cl2浓度,同时研究了最优条件下活性化糙米谷氨酸脱羧酶活力及主要物质含量变化。结果表明:最优培养条件为雾化液p H 3.5、VB6浓度2 mmol/L和Ca Cl2浓度10 mmol/L;在此条件下,活性化糙米中GABA含量可达7.67 mg/100 g,为原料糙米的2.74倍。随着活性化时间的延长,糙米中游离氨基酸、还原糖含量及谷氨酸脱羧酶活力呈现逐渐增加的趋势,可溶性蛋白及淀粉含量呈现逐渐下降趋势。相关性分析表明,GABA含量与谷氨酸、游离氨基酸、可溶性蛋白含量之间均显著相关。     

蔬菜发酵菌种的筛选及发酵特性

为了选择适合蔬菜发酵的发酵菌种,本研究从四川泡菜老汤中分离的6 种乳酸菌Lactobacillus plantarum、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus brevi、Lactobacillus pentosus、Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus lactics筛选发酵菌种。6 种乳酸菌接入亚硝酸盐的MRS培养液中,6 种乳酸菌还原亚硝酸盐的大小顺序为Lactobacilluspentosus＞Lactobacillus plantarum＞Leuconostoc mesenteroides＞Lactobacillus fermentum＞Lactobacillus lactics＞Lactobacillus brevis。以pH值降低的速率为发酵速率,Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pentosus、Leuconostocmesenteroides这3 种发酵剂的发酵速率较其他3 种快,并且通过乳酸菌的全细胞蛋白电泳实验得出此3 种乳酸菌在甘蓝发酵过程中能够成为优势菌。从乳酸菌还原亚硝酸盐的能力、发酵速率、发酵菌种的生存能力（是否能成为优势菌）的实验结果表明Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pentosus、Leuconostoc mesenteroides这3 种乳酸菌作为蔬菜发酵的发酵剂。通过对3 种发酵菌种发酵特性的研究可知,Leuconostoc mesenteroides较另两种生长周期短,稳定期维持时间短,很快进入衰退期。Lactobacillus plantarum菌较Lactobacillus pentosus、Leuconostoc mesenteroides耐酸,Leuconostoc mesenteroides对酸敏感。Leuconostoc mesenteroides最适生长温度为30 ℃,Lactobacillus plantarum、Lactobacillus plantarum两种菌的最适生长温度是37 ℃。15 ℃条件下Leuconostoc mesenteroides的光密度（OD600 nm）值很低,说明Leuconostoc mesenteroides较Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pentosus对低温敏感。     

布氏乳杆菌产γ-氨基丁酸发酵条件的优化

从中国传统发酵蔬菜中分离获得2株高产γ-氨基丁酸的布氏乳杆菌S37和布氏乳杆菌J68,为进一步提高其产γ-氨基丁酸的能力,对菌株的发酵条件进行优化。结果表明,2株菌产γ-氨基丁酸的最优条件为:发酵时间72 h、发酵温度35℃、底物L-谷氨酸钠浓度400 mmol/L、初始pH 5.0。在此条件下,菌株的γ-氨基丁酸产量分别为233.9 mmol/L和159.3 mmol/L,对应的L-谷氨酸钠转化率分别为58.5%和39.8%。单因素试验发现叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰的添加能显著提高菌株的γ-氨基丁酸产量,在此基础上进一步通过响应面试验对其进行优化,发现对于菌株S37最优添加水平分别为8.37 mg/L、0.94 g/L和0.60 g/L,对于菌株J68其最优添加水平分别为10.16 mg/L、0.97 g/L和0.60 g/L。在该最优条件下,2株菌的γ-氨基丁酸产量分别达到312.6 mmol/L和251.2 mmol/L,对应的L-谷氨酸钠转化率分别为78.2%和62.8%。     

产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及诱变育种

利用乳酸菌分离培养基从酸菜汁中分离菌株。经过初筛、复筛后得到的菌株Lp-Lw-131有较好的产γ-氨基丁酸(GABA)能力。对菌株进行形态学鉴定和生理生化实验确定该菌为植物乳杆菌,编号为Lp-Lw-131。利用菌株体内的谷氨酸脱羧酶(GAD)将L-谷氨酸钠脱羧转化成GABA,用比色法测定GABA的产量为0.917g/L。以Lp-Lw-131为出发菌株进行紫外线和硫酸二乙酯(DES)诱变,以致死率为标准确定最佳诱变条件为：紫外照射距离30cm,照射时间90s;DES体积分数为25%醇溶液,处理时间20min,诱变后获得一株突变株Lp-Lw-131-34。连续传代10次后遗传性状稳定,平均GABA产量为1.815g/L,是出发菌株的1.979倍。     

6 株乳酸菌在豆乳中的发酵特性

以干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、短乳杆菌（L. brevis）、嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）、植物乳杆菌（L. plantarum）、鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）和保加利亚乳杆菌（L. bulgaricus）分别发酵豆乳,测定发酵期间pH值、滴定酸度、游离氨基氮,发酵结束后的活菌数和质构参数,并且对所得产品进行感官评价。结果表明：发酵过程中前5 株菌发酵豆乳的pH值显著下降,而L. bulgaricus下降缓慢,发酵24 h pH值仅为5.2。这6 株菌发酵产品的活菌数均达到1.0×108 CFU/mL以上。结果表明L. casei、L. brevis、L. acidophilus和L. plantarum发酵得到的产品的坚实度、稠度、黏度、黏附性指数均较高,感官评定结果表明这4 株菌发酵豆乳产品得分均较高,容易被消费者接受,适合用于生产发酵豆乳产品。     

黄秋葵汁乳酸菌混菌发酵条件优化

为制备风味优良的乳酸发酵黄秋葵汁,研究了肠膜明串珠菌和植物乳杆菌以不同组合在发酵黄秋葵汁中的生长、产酸、感官品质以及挥发性风味成分。结果表明：植物乳杆菌单菌发酵黄秋葵汁可以在24 h内将pH值降到4.5以下,活菌数可达107 CFU/mL。肠膜明串珠菌单菌发酵黄秋葵汁无法顺利产酸。肠膜明串珠菌和植物乳杆菌以其菌液体积比2∶1混合发酵黄秋葵汁,可迅速将pH值降到4.5以下,活菌数可达108 CFU/mL,且感官品质优于植物乳杆菌单菌发酵。气相色谱-质谱联用方法分析可知,混菌发酵生成的挥发性成分比植物乳杆菌单菌发酵种类更多、含量更高。黄秋葵汁乳酸发酵最佳工艺条件为：肠膜明串珠菌和植物乳杆菌菌液以2∶1比例混合、接种量5%、发酵温度35 ℃、发酵时间72 h。     

黄浆水中高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及鉴定

经初筛、复筛,从黄浆水中筛得一株高产γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）的菌株,对其进行形态学及生理生化鉴定,并与GenBank上已提交的16S rDNA进行BLAST比对,结果表明,其归属于乳酸杆菌属（Lactobacillus）。由MEGA 6.0软件构建的系统发育树结果表明,该菌株与Lactobacillus plantarum 16S rDNA序列同源性达99%,且与生理生化实验结果一致,因此,确定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）,编号为LP-Dfa301,测得其发酵液中GABA产量为5.833 g/L。     

植物乳杆菌对食源性病原菌作用的研究

通过牛津杯法筛选得到几株高抑菌活性的植物乳杆菌,使用蛋白酶K和NaOH对这几株杆菌的发酵液上清进行处理,以大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌为指示菌,发现有机酸为主要抑菌物质,但是调节pH值至6.5后的发酵上清液可以对大肠杆菌有较好的抑菌效果。其中植物乳杆菌QB3-3具有长达96 h的持续抑菌效果。电子显微镜观察显示,植物乳杆菌抗病原菌的主要机理为破坏细胞结构,导致病原菌菌体形态改变,内容物流出,致使细胞死亡。