氨基酰化酶拆分制备手性蛋氨酸工艺条件研究

以N-乙酰DL-蛋氨酸(N-Ac-DL-Met)为拆分底物,对氨基酰化酶法拆分工艺参数如反应温度、pH、激活剂Co2 浓度以及底物浓度等因素进行了初步考察。结果表明,在反应温度37℃,缓冲体系pH7.5,Co2 浓度为0.5 mmol/L,初始底物N-Ac-DL-Met的浓度为0.06 mol/L,氨基酰化酶加入量为5μg/mL的较佳条件下,L-蛋氨酸(L-Met)的产率可达45%;产物L-Met结晶的光学纯度(用对映体过量值%e.e表示)为95.4%。实验中首次采用多组分标准曲线法,提高了茚三酮显色法在氨基酰化酶法拆分制备手性氨基酸的检测精确度     

米曲霉氨基酰化酶拆分DL茶氨酸

DL-茶氨酸经乙酰化可生成N-乙酰-DL-茶氨酸，然后利用米曲霉氨基酰化酶拆分N-乙酰-DL-茶氨酸可以获得L-茶氨酸。本文对氨基酰化酶酶促反应也进行了初步研究，考察了反应温度、反应时间、pH值和底物浓度等因素对酶促反应的影响。实验表明，转化温度40℃、转化时间30h、pH为7．0和底物浓度0．2mol／L时，目的产物L-茶氨酸的产率最高。     

重组氨基酰化酶1与N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶酶学性质比较

利用基因工程手段重组表达了牛肾来源的氨基酰化酶1(ACY1),并与实验室之前构建的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(NAO)进行比较,以N-乙酰-DL-蛋氨酸为底物,研究了其酶学性质,考察了pH、温度、反应时间、表面活性剂、金属离子等因素对拆分DL-蛋氨酸的影响。结果表明,重组NAO和ACY1拆分300 mmol/L的N-乙酰-DL-蛋氨酸所需时间分别是2 h和6 h;重组NAO的酶活及N-乙酰-L-蛋氨酸的转化率分别为1 139.41 U/g和98%,高于重组ACY1的671.24 U/g和58.78%,约是重组ACY1的1.7倍。     

刺孢小克银汉霉9980生物酶法制备D-苯丙氨酸

筛选到一株产氨基酰化酶的真菌刺孢小克银汉霉9980,直接利用其菌体细胞拆分N-乙酰-DL-苯丙氨酸,最终制得D-苯丙氨酸.最适反应条件为0.2 mol/L N-乙酰-DL-苯丙氨酸(含Co2+5×10-4 mol/L),0.04 g/mL菌体,在pH值为7.0、50 ℃条件下反应24 h,拆分率达90%以上.产物经JK008阳离子交换树脂分离.N-乙酰-D-苯丙氨酸经6 mol/L HCl加热回流4 h脱乙酰得D-苯丙氨酸.D-Phe[α]20D=+34.4°(水溶).     

乙酰-D-蛋氨酸消旋工艺的研究

在酶法拆分蛋氨酸的工艺中,经离子交换分离L-蛋氨酸后余下的N-乙酰基-D(L)-蛋氨酸溶液进行消旋反应,可将一部分N-乙酰基-D-蛋氨酸转变成L型乙酰基蛋氨酸后,可重新作为N-乙酰基D、L-蛋氨酸拆分底物使用。本文针对目前工厂实际生产中消旋产量和收率不太好的现状,利用正交试验法对影响消旋的各个因素作了分析,得出了较适宜的工艺条件,提高了产品的质量和收率。     

固定化米曲霉氨基酰化酶反应动力学及其连续拆分DL–蛋氨酸实验

探讨了用明胶-戊二醛固定化米曲霉菌球氨基酰化酶反应动力学,对固定化菌体连续光学拆分DL-蛋氨酸进行了研究. 当底物浓度小于200 mmol/L时,没有底物抑制现象,此时拆分反应速率符合Michaelis-Menten方程. 在37℃时, 米氏常数和最大反应速率分别为11.9 mmol/L和1.3 mmol/L. 在连续拆分反应中反应物体积流量为7.5 ml/h,底物浓度为200和400 mmol/L时,L-蛋氨酸的转化率分别为93%和78%. 随体积流量的增加,L-蛋氨酸转化率降低. 固定化菌体的操作半衰期为82 d.     

米曲霉3042细胞催化N-乙酰-D,L-3-三甲基硅丙氨酸不对称水解的研究

研究了米曲霉3042细胞催化N-乙酰-D,L-3-三甲基硅丙氨酸不对称水解反应,系统探讨了振荡速度、缓冲液浓度、反应温度和pH值对反应速度和反应选择性的影响.结果表明,上述因素对N-乙酰-D,L-3-三甲基硅丙氨酸不对称水解反应速率和反应选择性均有较显著的影响.振荡速度以170 r·min-1为宜,适宜的磷酸盐缓冲液浓度为0.10 mol·L-1,合适pH值为7.0,合适反应温度为50℃.在该优化反应条件下,以1g游离的米曲霉3042菌丝体催化10 m mol·L-1N-乙酰-D,L-3-三甲基硅丙氨酸不对称水解,反应初速度为0.42mmol·L-1·h-1,反应79 h,底物转化率为49.5%,产物L-三甲基硅丙氨酸的e.e.为92.7%.     

酶法拆分N-乙酰-D,L-丙氨酸反应控制步骤

研究了固定化米曲霉菌光学拆分N-乙酰-D,L-丙氨酸反应过程的速率控制步骤。在近似无限浴的条件下,通过测量间歇拆分反应产生的L-丙氨酸的浓度变化规律,判断反应过程中的速率控制步骤。结果表明,底物浓度和反应温度是影响速率控制步骤的重要因素,用得到的有效扩散系数进行模型计算,结果与实验值基本一致。     

米曲霉菌体光学拆分N-乙酰-DL-苯甘氨酸的动力学研究

用液相培养基培养的米曲霉菌体直接拆分N 乙酰 DL 苯甘氨酸,并对该酶促反应进行了初步研究。考察了反应温度、pH值、金属离子、底物浓度、产物浓度等因素对反应的影响。结果表明,酶促反应的最适反应温度和pH值分别为52℃和7.0,当底物浓度小于200mmol·L-1时,反应符合Michaelis Menten方程,当底物浓度大于200mmol·L-1时,反应存在底物抑制现象。进一步研究发现水解反应也存在着产物抑制现象。     

DL-苯丙氨酸的酶法拆分研究

利用氨基酰化酶能立体专一地水解氨基酰化物的特点,选择性地水解N-乙酰-L-苯丙氨酸得到L-苯丙氨酸,经分离后再水解N-乙酰-D-苯丙氨酸得到D-苯丙氨酸。研究中分别考察了pH值、温度、酶用量、底物浓度和钴离子对反应的影响。在优选条件下(底物浓度为0.1mol·L-1,pH7.0,温度37℃,酶用量为w(酶)/w(底物)=1∶41.4,加入浓度为1×10-3mol/L的Co2+,将N-乙酰-D-苯丙氨酸用有机溶剂结晶和盐酸水解10h)得到光学纯度OP=98.8%的L-苯丙氨酸,收率70.3%;OP=96%的D-苯丙氨酸,收率63%。     

生物酶法合成(S)-2-氨基-1-丁醇的研究

以粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶为催化剂,酶法拆分苯乙酰消旋底物转化生成(S)-2-氨基-1-丁醇。通过对催化过程中加酶量、底物浓度、反应温度、pH进行优化,确定最适酶催化条件是pH 9.0,40℃,底物浓度100 mmol/L,酶量2 U/mL,反应体积80 mL。在最适反应条件下,当消旋底物转化率达40%时终止反应可获得较高的产物光学纯度(ee>99%)。     

交联柚苷酶聚集体水解柚皮苷制备普鲁宁

为了提高普鲁宁的收率、简化分离提纯的工艺、得到较高纯度的普鲁宁,本实验采用交联柚苷酶聚集体水解柚皮苷制备普鲁宁,以普鲁宁浓度为优化指标,研究了底物浓度、p H、温度、加酶量、反应时间对制备普鲁宁的影响。利用正交设计对水解过程进行优化,确定最佳工艺条件为:柚皮苷浓度13.79 mmol/L、p H=8.0、温度65℃、加酶量18.0 mg/m L、反应时间12.0 h,优化后制备得到的普鲁宁浓度为13.36 mmol/L、收率达到96.87%。连续使用3个批次后,普鲁宁的收率可以达到91.29%,交联酶聚集体的稳定性较好。采用聚酰胺树脂对水解产物进行吸附,体积分数为40%~60%的异丙醇线性梯度洗脱,从0.36 g柚皮苷反应液中可以分离得到0.22 g普鲁宁。     

生物不对称合成R-(-)-扁桃酸的影响因素

研究了酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)生物不对称还原苯乙酮酸合成R-(-)-扁桃酸的过程中,环境因子对底物的转化效率和产物对映体过量值的影响. 结果表明,高浓度的底物苯乙酮酸对酵母细胞的催化还原活性具有较显著的抑制效应. pH 6.5、温度32℃、严格厌氧为较适宜条件,底物苯乙酮酸的转化率和产物扁桃酸的得率分别可达97.0%和96.1%,R-(-)-扁桃酸的对映体过量值(ee)为95.1%.     

金黄节杆菌CYC705腈水解酶催化亚氨基二乙酸合成的研究

将金黄节杆菌CYC705(Arthrobacter aurescens CYC705) 腈水解酶用于生物催化合成亚氨基二乙酸(IDA),从生物催化剂的形式、生物催化反应过程优化和反应体系放大三个方面进行了考察。在氨基载体固定化酶、环氧基载体固定化酶、海藻酸钠固定化细胞、壳聚糖固定化细胞和游离全细胞几种生物催化剂形式中,壳聚糖固定化细胞催化效率最高、稳定性最好。通过反应体系、反应温度、金属离子、底物浓度、固定化细胞投量等因素的优化,确定了最佳的生物催化反应条件：以50 mmol/L pH=6.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为反应体系,底物亚氨基二乙腈(IDAN)的浓度为200 mmol/L,添加CoCl2至终浓度为1 mmol/L,反应温度37 ˚C,固定化细胞投量为0.25 g每5 mL反应体积。在此条件下,反应2h可将IDAN完全转化为IDA。进一步将反应体系放大10倍,催化200 mmol/L的IDAN完全转化为IDA仅需1h。     

酶催化制备吡咯啉-5-羧酸和哌啶-6-羧酸的工艺

吡咯啉-5-羧酸(P5C)、哌啶-6-羧酸(P6C)是一类同代谢反应和疾病诊疗密切相关的环形亚胺化合物,在机体内氨基酸代谢中发挥重要作用。本研究利用Thermomicrobium roseum肌氨酸氧化酶对-C-N-键的催化能力建立了一种酶法制备工艺并进行了条件优化。通过薄层层析(TLC)、液质联用(LC-MS)和1H-NMR核磁共振鉴别出化合物结构,并建立了含量测定方法。单因素实验分析反应温度、pH和底物浓度对产量的影响,并通过响应面得到P5C最佳反应条件：温度为79.33℃、pH为8.54、底物浓度为112.82 mmol/L,P6C最佳反应条件：温度80.19℃、pH为8.31、底物浓度83.58 mmol/L。在此条件下反应30 min,P5C和P6C的产量分别为340.15±9.12, 450.87±8.54 mg/L。反应48 h后,转化率分别达到81.94%和99.99%。研究结果为酶法制备P5C和P6C奠定了理论基础,为吡咯啉、哌啶类化合物的合成提供了新的思路。     

谷氨酸脱羧酶工程菌的发酵工艺及酶学性质

对谷氨酸脱羧酶(GAD)工程菌DM201的发酵及转化条件进行优化,分析了发酵过程中异丙基-β-D-巯基半乳糖苷(IPTG)诱导条件、转化体系pH、底物浓度和金属离子等因素对谷氨酸脱羧酶活力的影响。发酵过程中最佳IPTG诱导条件为:浓度0.4mmol/L、时间5h、温度30℃;转化温度45℃,pH=4.0,ρ(L-谷氨酸)≈110g/L,镁离子在50mmol/L和5mmol/L浓度时对谷氨酸脱羧酶酶活有稳定作用,铜锌离子对其酶活的抑制作用显著。     

黄铜表面镧转化膜在模拟雨水中的腐蚀行为

采用化学浸泡法在黄铜表面制得镧转化膜,转化液组成与工艺条件为:硝酸镧3.5～5.5g/L,苯并三氮唑8.0～12.0g/L,磺基水杨酸8.0～12.0g/L,柠檬酸15.0g/L,温度60℃,pH4,时间3min。采用原子吸收光谱和电化学法研究了黄铜/镧转化膜在模拟雨水中的腐蚀行为。在相同的浸泡时间内,黄铜/镧转化膜在模拟雨水中溶解的铜离子质量浓度低于黄铜基体。在酸性范围内,模拟雨水的pH越高,黄铜/镧转化膜越不容易被腐蚀。镧转化膜对溶解于雨水中的SO2-4和Cl-较敏感,Cl-含量的增加使黄铜/镧转化膜的点蚀增强,SO2-4含量的增加使膜层整体发生严重腐蚀;NO-3含量则对其腐蚀行为的影响不大。黄铜/镧转化膜在pH=3.29的模拟雨水中的腐蚀经历3个阶段。     

利用色氨酸酶酶法拆分D,L-丝氨酸制备D-丝氨酸

以D,L-丝氨酸为底物,采用色氨酸酶将L-丝氨酸转化为L-色氨酸,并进一步分离纯化拆分得到D-丝氨酸。该文对色氨酸酶酶法拆分条件进行了响应面优化,酶促反应最佳条件为:温度45℃,pH=8.0,反应时间18 h,底物D,L-丝氨酸质量浓度30 g/L,色氨酸酶用量为6 g/L,经过两次转化,L-丝氨酸的总转化率可达95.4%。酶促反应液经NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂与001×7强酸性阳离子交换树脂纯化,重结晶后得到D-丝氨酸,化学纯度99.4%,α2D0=-15.3°(ρ=0.1 kg/L,2 mol/L HCl),总回收率为66.6%。     

Simultaneous saccharification and fermentation of wheat bran flour into ethanol using coculture of amylotic Aspergillus niger and thermotolerant Kluyveromyces marxianus

Studies on simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of wheat bran flour, a grain milling residue as the substrate using coculture method were carried out with strains of starch digesting Aspergillus niger and nonstarch digesting and sugar fermenting Kluyveromyces marxianus in batch fermentation. Experiments based on central composite design (CCD) were conducted to maximize the glucose yield and to study the effects of substrate concentration, pH, temperature, and enzyme concentration on percentage conversion of wheat bran flour starch to glucose by treatment with fungal α-amylase and the above parameters were optimized using response surface methodology (RSM). The optimum values of substrate concentration, pH, temperature, and enzyme concentration were found to be 200 g/L, 5.5, 65°C and 7.5 IU, respectively, in the starch saccharification step. The effects of pH, temperature and substrate concentration on ethanol concentration, biomass and reducing sugar concentration were also investigated. The optimum temperature and pH were found to be 30°C and 5.5, respectively. The wheat bran flour solution equivalent to 6% (w/V) initial starch concentration gave the highest ethanol concentration of 23.1 g/L after 48 h of fermentation at optimum conditions of pH and temperature. The growth kinetics was modeled using Monod model and Logistic model and product formation kinetics using Leudeking-Piret model. Simultaneous saccharificiation and fermentation of liquefied wheat bran starch to bioethanol was studied using coculture of amylolytic fungus A. niger and nonamylolytic sugar fermenting K. marxianus.