牛奶过敏原β-乳球蛋白的单克隆抗体制备及其双抗体夹心法的建立

目的制备与鉴定牛奶主要过敏原β-乳球蛋白(β-LG)的单克隆抗体,并建立双抗体夹心检测法。方法以β-LG为抗原免疫BALB/c小鼠,融合免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1。半固体培养基法结合有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,采用蛋白A亲和层析法获得纯化抗体。利用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型。间接ELISA方法和Western Blot鉴定抗体效价和特异性以及与其他过敏原的交叉反应性。建立双单克隆抗体夹心法,检测β-LG。结果共获得抗β-LG细胞株6株,分别命名为1H8,4A7,4C3,1F9,1G5,3D11,效价均高于20万。经抗体亚型鉴定,6株抗体均为Ig G1型。Western Blot的结果表明6株抗体能识别β-LG。在特异性检测实验中,6株抗体与其他种类食物过敏原无交叉反应,而1G5和3D11与牛奶酪蛋白过敏原有交叉反应性。通过建立双单克隆抗体夹心ELISA法,发现牛奶β-LG蛋白的检出低限为:15.625 ng/m L,标准曲线在15.625~250 ng/m L范围内线性良好。结论获得高效价抗体6株,建立了高效、高特异性的牛奶过敏原β-LG的检测方法,为食品中牛奶过敏原的检测提供了依据。     

抗水牛乳β-乳球蛋白兔IgG的亲和纯化

为得到兔血清中纯度较高的特异性抗体,通过将纯化的水牛乳β-乳球蛋白耦联到免疫亲和柱上,用3mol/L氯化镁将特异性的IgG洗脱,得到了SDS-PAGE纯的IgG,其蛋白含量为5.8mg/ml,经ELISA检测滴度为1:109。本实验所建立的方法可用于纯化兔血清中特异性的IgG。     

抗Cry1c蛋白兔单克隆抗体的制备和鉴定

通过原核质粒表达重组Cry1c晶体蛋白,将其纯化后作为特定抗原免疫兔子。经多抗血清效价的测定,细胞融合,杂交瘤细胞的筛选,构建重组载体等步骤获得抗Cry1c单克隆抗体。通过ELISA方法测定单克隆抗体相关特性,结果表明,Cry1c兔单克隆抗体效价超过3.2×104,其亲和常数为2.4×109L/mol,该单克隆抗体与Cry1Ac蛋白有微量交叉反应,与Cry1Ab蛋白无明显交叉反应。间接ELISA检测抗原Cry1c蛋白时,当包被量为400ng/mL时,判定为阳性。     

牛乳β-酪蛋白检测的间接ELISA方法

将从干酪素中提取的牛β-酪蛋白对新西兰白兔进行多次皮下免疫注射.采集血清并用硫酸铵沉淀法进行抗体纯化,以制备兔抗牛β-酪蛋白的多克隆抗体.最后将纯化的抗体用于间接ELISA法检测牛乳β-酪蛋白的含量.     

β-伴大豆球蛋白多克隆抗体的制备及纯化前后免疫学特性鉴定

以β-伴大豆球蛋白免疫新西兰兔,制备抗β-伴大豆球蛋白多克隆抗体。利用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化多抗血清,并分析纯化前后多抗血清蛋白含量、纯度、效价、敏感性及特异性。结果表明,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化后血清纯度得到提高;间接ELISA法检测多抗血清效价及敏感性无明显变化;与大豆Gly m Bd 28K蛋白和花生蛋白的交叉反应率分别由25.28%、1.16%降至为0.79%、0.2%。制得的抗β-伴大豆球蛋白多克隆抗体特异性高。为β-伴大豆球蛋白致敏蛋白的检测,和大豆β-伴大豆球蛋白致敏亚分子结构的定位奠定了基础。     

牛奶过敏原β-乳球蛋白抗体的制备及免疫检测方法的建立

本文将牛奶过敏原β-乳球蛋白抗原分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠制备其多克隆抗体和单克隆抗体,并对所获得的抗体进行了效价等特性测定;采用蛋白A亲和层析法将多克隆抗体进行了纯化,采用辛酸-硫酸铵法对单抗细胞株3A7进行了纯化;实验建立了双抗体夹心的ELISA检测方法,并对一些蛋白样品进行了初步的检测。实验结果表明,所制备的抗β-乳球蛋白兔多克隆抗体效价达到了1:6.56×106;Western-blotting鉴定结果显示所制备的多克隆抗体能够与β-乳球蛋白特异性反应;3株单抗的效价均在106以上,纯化后多抗仅与酪蛋白有一定的交叉反应,而纯化后单抗与乳中主要蛋白及其它过敏原蛋白基本没有交叉反应,特异性很好;利用所建立的方法对一些蛋白样品进行检测,准确率100%。     

测定三种乳蛋白抗原性间接竞争ELISA法的建立

为检测牛乳中主要致敏蛋白的抗原性,以商业兔抗αs-酪蛋白、兔抗β-乳球蛋白、兔抗牛血清白蛋白(BSA)多克隆抗体为一抗,标记HRP的羊抗兔Ig G为二抗,TMB为底物,对牛乳中主要致敏蛋白:αs-酪蛋白、β-乳球蛋白、BSA建立间接竞争ELISA(ic ELISA)。结果表明,αs-酪蛋白、β-乳球蛋白及BSA抗原包被质量浓度分别为5,2和2μg/m L。一抗最佳稀释倍数分别为1∶800,1∶400和1∶300。建立的三种蛋白的ic ELISA的线性检测范围分别为15.625~1 000 ng/m L、31.25~1 000 ng/m L和62.5~2 000 ng/m L。三种乳蛋白包被条件均为4℃,12 h,酶标二抗的最佳稀释倍数为1∶1 200,以1%的明胶作为封闭液。三种乳蛋白ic ELISA的3个浓度添加试验的批内及批间最大变异率分别为5.16%,7.46%,6.6%和6.78%,6.81%,6.06%,三种蛋白建立的ic ELISA回收率在94.34%~109.92%。表明所建立的方法重复性好,灵敏度高,可用于牛乳中此三种蛋白致敏性的测定。     

多酚氧化酶交联β-酪蛋白的抗原性变化初步研究

利用多酚氧化酶催化牛乳β-酪蛋白交联,并通过ELISA方法检测交联前后β-酪蛋白抗原性的变化。SDS-PAGE结果显示,多酚氧化酶可以有效地催化β-酪蛋白交联。同时,间接竞争ELISA检测的β-酪蛋白交联后的半抑制浓度(IC50值)由2.63μg/mL变为4.07μg/mL,表明交联后β-酪蛋白抗原性明显降低。本研究工作为通过多酚氧化酶交联制备低致敏性乳制品提供了部分理论依据。     

间接竞争ELISA检测核桃制品中核桃蛋白含量

通过核桃蛋白组分分析,确定核桃丰度蛋白。以其作为抗原免疫小鼠,制备可特异性识别核桃蛋白的单克隆抗体,建立间接竞争ELISA检测方法。筛选出一株能稳定分泌抗核桃蛋白的杂交瘤细胞株HT-1,对间接竞争ELISA方法的反应条件进行优化后,建立了检测核桃蛋白的间接竞争ELISA方法,核桃蛋白的检测线性范围在4.6~64.2μg/mL,IC_(50)为17.2μg/mL,最低检测限为0.67μg/mL。抗体特异性较好,与其他的植物蛋白没有交叉反应。该方法适用于检测核桃制品中的核桃蛋白含量。     

重金属铜的单抗的制备及免疫学检测方法的建立

目的:制备针对重金属铜离子的单克隆抗体,建立Cu2+的间接和直接竞争ELISA检测法,实现对Cu2+的快速定量测定。方法:利用双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA将Cu2+分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,制备免疫原和检测原;用免疫原免疫Balb/c小鼠;细胞融合后,通过间接及间接竞争ELISA筛选稳定分泌抗重金属铜的单克隆抗体的杂交瘤细胞株;制备腹水型单抗并进行鉴定;建立间接竞争ELISA和直接竞争ELISA。结果:成功筛选出4株稳定分泌抗重金属铜的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中G8制备出腹水型单抗效价为5×105倍,抗体亚型为Ig G1型,轻链类型为κ型,特异性检测结果表明该单抗对NOTA及Mn2+、Pb2+、Cd2+、Zn2+等其金属离子交叉反应率远低于2%,与Mg2+交叉反应率小于8%,表明单克隆抗体G8对重金属Cu2+具有很强的特异性,不会干扰结果的准确性;建立间接竞争ELISA的检测灵敏度为29.8 ng/m L,检测限为2.4 ng/m L,线性范围为4.5~196.7 ng/m L;直接竞争ELISA检测法的检测灵敏度为12.89 ng/m L,检测限为0.88 ng/m L,检测范围为1.72~96.58 ng/m L。结论:成功制备出抗重金属铜离子的单克隆抗体,并建立了间接竞争ELISA和直接竞争ELISA。     

牛β-乳球蛋白胶体金免疫层析试纸条的研制及检测应用

研制了一种可快速检测羊乳及制品中牛源β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-lg)的胶体金免疫层析试纸条。通过杂交瘤技术制备牛β-lg特异性单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),利用柠檬酸钠还原氯金酸,形成30 nm胶体金颗粒,并用于标记牛β-lgmAb。采用竞争法研制免疫层析试纸条,将胶体金标记的牛β-lgmAb包被于金标垫,牛β-lg和羊抗鼠IgG标记于硝酸纤维素膜分别作为检测线(T线)和质控线(C线),牛β-lg和二抗的最佳包被浓度均为1.0 mg/mL。制得的单克隆抗体纯度都在90%以上,效价均在10000以上且特异性较好。该试纸条对牛β-lg的检测限(limit of detection,LOD)值为3.13μg/mL,对牛源α-CN,牛源β-CN,牛源κ-CN,牛源α-LA,BSA均未产生交叉反应,对脱脂羊乳粉中掺杂脱脂牛奶粉的LOD值为5%,并用该方法对市售羊奶及配方羊奶粉进行分析,检测结果与商品化的ELISA试剂盒一致。该方法前处理快速简单,可在5 min内对牛β-lg进行检测,可用于羊乳制品的现场快速检测。     

小麦球蛋白单克隆和多克隆抗体制备及建立酶联免疫吸附法快速检测技术

目的建立小麦球蛋白的ELISA检测技术,用于蛋白质掺假以及过敏原成分的快速检测。方法从麦胚粉中提取球蛋白,抗原免疫Balb/c小鼠进行4次免疫后,通过脾脏细胞杂交瘤技术及间接ELISA筛选制备单克隆抗体,同时制备兔抗小麦球蛋白的多克隆抗体。通过棋盘滴定法,初步确定单克隆抗体和多克隆抗体的最佳工作浓度,建立双抗夹心ELISA。结果通过免疫和杂交瘤技术获得了抗小麦球蛋白的单克隆抗体,纯化后抗体的效价均达到1:107,通过免疫兔制备的多克隆抗体经纯化后效价在1:2.4×105左右,所建立的双抗体夹心ELISA方法最低检测限为10 ng/m L,与其他物种的蛋白不发生交叉反应。结论本文建立的双抗体夹心ELISA方法具有良好的特异性和灵敏度,为建立乳品中小麦成分掺假及过敏原成分快速检测提供理论依据。     

低聚半乳糖糖基化对β-乳球蛋白诱导产生IgE的抑制作用

用低聚半乳糖对牛乳β-乳球蛋白进行糖基化处理,通过间接ELISA以及动物试验检测该结合产物的抗原性和免疫原性,结果表明糖基化处理能有效降低牛乳β-乳球蛋白的抗原性和免疫原性。通过动物试验和双抗体夹心ELISA方法检测牛乳β-乳球蛋白诱导产生IgE的量,结果表明低聚半乳糖糖基化对牛乳β-乳球蛋白诱导产生IgE具有显著抑制作用。     

乳品中β-内酰胺类抗生素快速检测试纸条研制

通过β-内酰胺类抗生素-载体蛋白偶联物的合成,单克隆抗体的制备与纯化,胶体金标记物的制备,β-内酰胺类抗生素单克隆抗体-胶体金标记物的制备并冻干到微孔试剂,样品吸收垫和反应膜的制备等研究过程,研制出乳制品中β-内酰胺类抗生素的快速检测试纸条。检测限分别为:青霉素G2μg/L、氨苄青霉素4μg/L、阿莫西林5μg/L、苯唑青霉素/邻青霉素/双青霉素均为6μg/L、头孢洛宁10μg/L、萘夫西林20μg/L、头孢喹肟20μg/L、头孢曲松25μg/L、头孢哌酮50μg/L、头孢噻呋90μg/L;本试纸条特异性好、假阳性率不高于3%、假阴性率为0,检测时间不超过15min,检测限量达到了我国和欧盟的要求,适用于乳品流通环节乳品中β-内酰胺类抗生素残留的检测。     

食物过敏原水牛乳β-乳球蛋白的交叉反应研究

β-乳球蛋白是乳清中一种主要蛋白质,而且是乳中主要过敏原之一.本研究探讨β-乳球蛋白与其它蛋白的免疫交叉反应性.采用间接ELISA法和免疫印迹的方法,利用β-乳球蛋白和相应的多克隆抗体,检测其交叉反应.结果表明,β-乳球蛋白不仅与水牛乳中其它蛋白有交叉反应,与其他乳源的β-乳球蛋白也有交叉反应.β-乳球蛋白的交叉反应较强,也是导致乳类食物过敏的主要原因之一.     

抗副溶血弧菌OMPK单克隆抗体的制备及其ELISA双抗体夹心检测方法建立

制备全长和截短的弧菌外膜蛋白K（outer membrane protein K,OMPK）,纯化后的OMPK免疫6～8 周雌性BALB/c小鼠,间接夹心酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测小鼠的血清效价,结果表明全长OMPK重组蛋白制备的血清效价是截短OMPK1重组蛋白制备血清效价的128 倍。通过全长的OMPK重组蛋白制备多株用于检测副溶血弧菌的单克隆抗体,用生物素（biotin）和辣根过氧化物酶对单克隆抗体进行标记。间接夹心ELISA实验结果表明：只有VP3-biotin和VP16-biotin与其他单克隆抗体配对检测不同的副溶血弧菌菌株表现出较高的灵敏度及良好的特异性,并且在检测其他种属20 株菌时无交叉反应。VP16(Fab)-biotin/VP3检测副溶血弧菌时较VP16-biotin/VP3具有更高的灵敏度,该方法用于检测海鲜样品时,VP16-biotin/VP3检测三文鱼（5～10 CFU/25 g）和血蚶样品为副溶血弧菌阳性。本研究开发了一种快速、灵敏、简便的副溶血弧菌间接夹心ELISA检测方法。     

间接竞争ELISA法检测牛乳中β-乳球蛋白含量的准确性评价

研究建立了以β-乳球蛋白标准品为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG:HRP为二抗、邻苯二胺为底物的间接竞争酶联免疫检测法(indirect competitive enzyme-linked immu nosorbent,ELISA)。同时以反相高效液相色谱法定量检测相同样品中β-乳球蛋白含量,采用t检验方法来评价间接竞争ELISA的方法定量检测β-乳球蛋白的准确性。t检验方法结果显示:在显著水平α=0.05下,该间接竞争ELISA法检测β-乳球蛋白的测量值较为准确。     

牛奶主要过敏原β-乳球蛋白的一基因片段的克隆、表达、纯化及抗原性鉴定

目的 克隆并表达牛奶中主要过敏原β-乳球蛋白(β-LG)的一基因片段,并检测其杭原性.方法 利用RT-PCR技术克隆β-LG蛋白基因片段,测序后将目的片段克隆入原核表达质粗pET载体,转化至大肠杆菌origami,经IPTG诱导表达,获得重组β-LG片段蛋白.用Nit~2+亲和层析柱纯化,用Western blot和ELLSA检测重组蛋白与牛奶过敏患者血清IgE的结合活性.结果 克隆获得β-LG片段蛋白,其开放阅读框基因为264 by(含终止密码子),编码87个氨基酸.获得的重组β-LG片段蛋白既以包涵体形式存在又以可溶性形式存在,用可溶性的蛋白进行纯化,经Western blot和ELISA检测具有较好的抗原性.结论 成功地克隆和表达了β-LG的--基因片段,为后续牛奶的免疫原性研究提供参考,也为研制牛奶主要过敏原的单克隆抗体和制备其主要过敏原的检测试剂奠定了基础.     

胶体金免疫层析法快速检测配方羊奶粉中的牛β-乳球蛋白

建立了一种可快速检测配方羊奶粉中牛β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-lg)的胶体金免疫层析检测方法。通过杂交瘤技术制备β-lg单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),半抑制浓度(50% inhibiting concentration,IC₅₀)为5.87 μg/mL。将胶体金标记的β-lg mAb包被于金标垫,β-lg和山羊抗小鼠IgG标记于硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane,NC膜)分别作为检测线(T线)和质控线(C线),开发了可检测β-lg的免疫层析试纸条。该试纸条对β-lg的检测限(limit of detection,LOD)值为50 μg/mL,与其他基质成分均未产生有效交叉反应,对全脂山羊乳粉中掺杂脱脂牛奶粉(nonfat skim milk,NFSM)、脱盐乳清粉(desalted whey powder,DWP)和乳清蛋白粉(whey protein powder,WPP)的LOD值分别为5%、5%和0.1%。运用该方法对9个市售配方羊奶粉进行分析,检测结果与商品化酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒一致。该方法前处理快速简单,5 min即可裸眼判定结果,可用于配方羊奶粉商品的现场快速检测。     

抗水牛乳β-乳球蛋白兔lgG的亲和纯化

为得到兔血清中纯度较高的特异性抗体，通过将纯化的水牛乳β-乳球蛋白耦联到免疫亲和梓上，用3mol／L氯化镁将特异性的IgG洗脱，得到了SDS-PAGE纯的IgG，其蛋白含量为5．8mg／ml，经ELISA榆测滴度为1：109。本实验所建立的方法可用于纯化兔血清中特异性的IgG。