小鼠白细胞介素-13受体α2胞外区的原核表达与纯化

目的原核表达并纯化小鼠白细胞介素-13受体α2胞外区(sIL-13Rα2)。方法将sIL-13Rα2基因克隆入原核表达载体pROEXHTa,构建重组表达质粒pROEXHTa/sIL-13Rα2,经双酶切鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。薄层扫描分析目的蛋白的表达量,并对其进行表达形式分析及Westernblot鉴定。镍柱亲和层析纯化目的蛋白。结果重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确。表达的sIL-13Rα2蛋白相对分子质量约为36200;诱导6h,重组蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的45%;重组蛋白以包涵体形式存在,可与大鼠抗小鼠sIL-13Rυ2单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度大于95%。结论已成功表达并纯化了sIL-13Rα2,为进一步探讨其治疗支气管哮喘奠定了基础。     

鼠白细胞介素-2(mIL-2)真核表达质粒的构建及蛋白检测

目的构建重组鼠白细胞介素2的真核表达体系,获得mIL2基因的表达质粒,用其提高DNA疫苗的免疫原性。方法从经PMA刺激的小鼠脾细胞中提取总RNA,采用RTPCR技术调取鼠白细胞介素2基因,并将其克隆至真核表达质粒VR1012中,转染COS7细胞,将转染细胞裂解,进行Westernblot检测。结果获得完整的带有信号肽的mIL2序列的质粒,经Westernblot检测阳性。结论构建了mIL2真核表达体系,并获得有生物活性的mIL2蛋白。     

猪白细胞介素-2基因的原核表达、纯化及其生物学活性

目的原核表达、纯化猪白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2),并检测其生物学活性。方法以提取的猪外周血淋巴细胞基因组RNA为模板,PCR扩增猪IL-2基因,插入原核表达载体pBV220,构建重组表达质粒pBV220/IL-2。将重组表达质粒转化感受态大肠埃希菌DH5α,经含Amp的LB平板筛选后,将重组菌于LB培养液中培养,分别于不同培养时间进行活菌计数,绘制重组菌的生长曲线;42℃诱导表达重组蛋白,经尿素纯化后,采用CTLL细胞/MTT比色法检测其生物学活性。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定构建正确;重组菌的最佳开始诱导时间为重组菌发酵培养10 h;重组蛋白相对分子质量约17 400,表达量占菌体总蛋白的19%,纯化后纯度达95%;重组蛋白的生物学活性可达3×105IU/ml。结论原核表达并纯化了具有生物学活性的重组猪IL-2蛋白,为其进一步研究和产业化生产奠定了基础。     

鼠抑铁素2蛋白的原核表达及鉴定

目的表达鼠抑铁素2(lcn2)蛋白,并检测表达产物的生物学活性。方法从小鼠RAW264.7巨噬细胞提取总RNA,逆转录合成cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增lcn2基因片段,插入原核表达质粒pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,用IPTG诱导表达。表达产物经His-tagin-gel stain鉴定后,采用Ni2+-NTA亲和层析纯化,并检测其生物学活性。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定,表明重组质粒pET-32a(+)-lcn2构建正确。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为21000,表达量占菌体总蛋白的35%,主要以包涵体形式存在。纯化后蛋白浓度为1.0g/L,并对大肠杆菌和乙型链球菌生长有一定的抑制作用。结论成功地在原核细胞中表达了重组lcn2蛋白,且表达的蛋白具有一定的抑菌作用。     

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白功能性片段的原核表达及其免疫保护性

目的表达猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)的功能性片段(tmrp),并检测其对小鼠的免疫保护性。方法将构建的重组克隆载体pMD-tmrp经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,将切下的目的基因tmrp亚克隆至原核表达载体pGEX-3X中,转化E.coliBL21(DE3),鉴定正确后,用IPTG诱导,谷胱甘肽亲和层析纯化GST-tmrp,免疫BALB/c小鼠,测定其免疫保护率。结果阳性工程菌经IPTG诱导,表达了可溶性目的蛋白,相对分子质量约为73000。0.8mmol/LIPTG,37℃,pH7.2诱导4h,表达量最高,为25.36%。经亲和层析纯化,融合蛋白纯度达93.7%。免疫BALB/c小鼠后,免疫保护率可达60%。结论已成功获得了具有免疫活性的GST-tmrp。     

HEV ORF2截短融合蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达3型戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)第2个开放阅读框(open reading frame 2,ORF2)截短融合蛋白(HEV3-179-Fe),并检测其免疫原性。方法分别扩增HEV3-179和Fe蛋白基因片段,经Overlap PCR法连接并扩增,克隆至载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-HEV179-Fe,将其转化感受态E. coli BL21(DE3),取阳性菌株,IPTG诱导表达融合蛋白HEV3-179-Fe,进行10%SDS-PAGE分析。目的蛋白经镍离子金属鳌合亲和层析纯化后,加入硫酸铵进行病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)重构,置电镜下观察。HEV3-179-Fe蛋白VLPs与氢氧化铝佐剂吸附后免疫小鼠,ELISA法测定效价,以评价HEV ORF2截短融合蛋白的免疫原性。结果重组表达质粒pET-28a-HEV3-179-Fe构建正确。目的蛋白HEV3-179-Fe相对分子质量约40 000,主要以包涵体形式存在,表达量均达35%以上,纯度约95%,可与鼠抗HEV 3多抗发生特异性反应。硫酸...     

人颗粒酶B融合蛋白的原核表达及其免疫血清的制备

目的在原核体系中表达人颗粒酶B(granzyme B,Gzm B)融合蛋白,并制备Gzm B免疫血清多克隆抗体。方法构建Gzm B原核表达重组质粒p ET32a-Gzm B,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组Gzm B(r Gzm B)蛋白,镍离子螯合亲和层析柱纯化表达产物。以纯化的r Gzm B蛋白为免疫原,皮下多点注射BALB/c小鼠,共免疫3次,分别于免疫后2、4、6周经小鼠尾静脉采血,分离血清,间接ELISA法检测免疫血清中Gzm B特异性Ig G抗体水平,并确定其抗体最大稀释度,免疫斑点试验检测免疫血清多克隆抗体对Gzm B的特异免疫结合特性。结果质粒p ET32aGzm B经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的r Gzm B蛋白相对分子质量为48 000;纯化的r Gzm B蛋白免疫小鼠血清中Gzm B特异性Ig G抗体水平随免疫时间延长至第4周达到高峰,随后维持一定水平;抗体最大稀释度为1∶1 600;r Gzm B免疫血清能够特异地结合Gzm B,显示了其免疫结合特性。结论制备了r Gzm B蛋白和Gzm B小鼠免疫血清多克隆抗体,为后续开展Gzm B的靶向杀伤、靶向检测等应用研究奠定了基础。     

CTP-OD-HA融合蛋白的原核表达及其活性鉴定

目的构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,表达并纯化融合蛋白,并检测其在人慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞株中的转导活性及胞浆定位。方法分别将胞浆转导肽(CTP)、寡聚化区域(OD)基因和流感病毒血凝素抗原表位(HA)片段依次连接入pET32a(+)质粒,构建重组原核表达质粒pCTP-OD-HA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经亲和纯化、Western blot验证、肠激酶切割、目的蛋白回收和FITC标记后,将FITC-CTP-OD-HA融合蛋白作用于K562细胞,观察其转导活性及细胞定位。结果重组原核表达质粒pCTP-OD-HA经酶切及测序鉴定,证明构建正确。37℃,1 mmol/LIPTG诱导4h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的35%,纯化后纯度达95%以上。FITC-CTP-OD-HA融合蛋白在K562细胞中具有高转导活性和显著的胞浆定位特性。结论已成功构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,并高效表达了目的蛋白,为进一步研究其在CML信号转导通路中的作用,阐明CML的发病机制及探讨蛋白肽在CML中的治疗策略奠定了基础。     

重组小鼠白细胞介素-17F/His融合蛋白的原核表达、纯化及生物活性

目的在大肠杆菌(E.coli)中表达并纯化重组小鼠白细胞介素-17F(rmIL-17F),并鉴定其生物活性。方法经RT-PCR扩增mIL-17f基因片段,定向插入原核表达载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a/mIL-17f,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni2+-NTA亲和层析纯化rmIL-17F/His融合蛋白,Western blot鉴定其反应原性。以纯化复性的rmIL-17F滴鼻干预小鼠,采用实时荧光定量PCR法检测小鼠肺组织IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测小鼠外周血IL-17F、IL-4和IFNγ的水平。结果扩增的mIL-17f基因DNA序列与GenBank中登录的mIL-17f基因序列一致,所构建的重组表达质粒pET28a/mIL-17f构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为19000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度约为95%,具有良好的反应原性,经黏膜给药后,可促进小鼠肺组织中IL-6 mRNA的表达,并提高小鼠血清中IL-4和IFNγ的水平。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达并纯化了具有生物学活性的rmIL-17F,为进一步研究IL-17F的功能奠定了基础。     

白藜芦醇对脓毒症大鼠急性肺损伤的保护作用及对巨噬细胞炎症蛋白-2、IL-10、IL-18表达的影响

目的研究白藜芦醇(Resveratrol,Res)对脓毒症大鼠急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)的保护作用及对ALI大鼠肺组织中巨噬细胞炎症蛋白-2(Macrophage inflammatory protein,MIP-2)、白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)和白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)表达的影响。方法将SD大鼠随机分为空白对照组(Con组)、假手术组(Sham组)、脓毒症组(Sep组)和白藜芦醇组(Res组)。采用盲肠结扎穿刺术(Cecal ligation and puncture,CLP)制备脓毒症相关性ALI大鼠模型,造模24 h后,Res组给予0.3 ml/100 g的Res液,Con、Sham和Sep组给予等量生理盐水,均经尾静脉注射。各组分别于0、6、12、24和48 h,取大鼠肺组织,HE染色观察病理形态学变化,计算肺湿重/干重比值(W/D);ELISA法检测各组大鼠血浆中MIP-2、IL-10和IL-18含量;Western blot法检测各组大鼠肺组织中MIP-2、IL-10和IL-18蛋白的表达水平。结果 Res组在造模后12 h,肺组织病理变化与Sep组相比有所减轻,48 h Res作用达到最强,各种病理改变明显减轻,部分肺组织开始接近正常形态;肺组织W/D比值与Sep组相比均明显降低(P<0.05);Res组在12、24和48 h MIP-2水平均明显低于同时间点Sep组(P<0.05),在24和48 h IL-10水平明显低于同时间点Sep组(P<0.05),12、24和48 h IL-18水平明显低于同时间点Sep组(P<0.05)。Western blot结果显示,造模后24 h,Res组MIP-2、IL-10和IL-18蛋白表达水平明显低于Sep组(P<0.05)。结论白藜芦醇能有效减轻脓毒症所致ALI,作用与抑制MIP-2、IL-10和IL-18的过度表达,实现内稳态有关。     

抑制新城疫病毒繁殖的九肽及其突变体基因的克隆与原核表达

目的克隆并表达抑制新城疫病毒(NDV)繁殖的九肽(Nonapeptide)及其突变体基因。方法设计并合成Non-apeptide2串联体及其突变体基因,克隆于质粒pUC18,经酶切回收目的基因,与经相同酶切的表达载体pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性菌落,抽提质粒进行鉴定。IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定,证明构建正确。阳性重组菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约29000处可见一明显条带,与理论值相符。Nonapeptide 2及其突变体蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的41%和37%。Western blot结果显示两种蛋白均具有良好的反应原性。结论已成功克隆并表达了抗NDV繁殖的Nonapeptide及其突变体基因。     

HBV PreS2-MBP融合蛋白质粒构建及在大肠杆菌中的表达

目的在大肠杆菌pMALP2x系统中表达HBVPreS2MBP融合蛋白,并对其进行鉴定和纯化。方法利用DNA重组技术,将全长的HBVPreS2蛋白基因克隆至原核表达载体pMALP2x中,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。表达产物经SDSPAGE和Westernblot检测,并经阴离子交换层析、AmyloseResin亲和层析纯化。结果成功构建了重组载体pMALP2x/S2,诱导蛋白为MBP标记的可溶性的PreS2MBP融合蛋白,具有良好的抗原性,可经AmyloseResin亲和层析纯化。结论pMALP2x系统可成功表达PreS2MBP融合蛋白。     

百日咳毒素S1亚单位突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的克隆百日咳毒素S1亚单位,获得其突变体(S1/9K-129G,rS1),构建原核表达系统,并鉴定融合蛋白的特异性。方法采用PCR和重叠延伸扩增得到突变体,将其与pMD18-T连接,转化至大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-T-rS1,经双酶切得到rS1活性结构域编码片段。将其插入pQE-30载体中,转化大肠杆菌M15株,经IPTG诱导表达。表达产物经镍离子柱纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果PCR及重叠延伸获得了约700bp的目的基因片段,并获得阳性重组表达载体克隆,表达产物为相对分子质量27000左右的蛋白,Western blot检测能与兔抗百日咳毒素多价抗血清发生反应。结论成功表达并纯化了百日咳毒素S1亚单位突变体,为研制百日咳疫苗候补抗原的相关分子免疫学研究奠定了基础。     

天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白的原核表达、纯化与发酵

目的原核表达天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,并进行纯化和发酵。方法全基因合成带有凝血酶切割位点的天蚕素B和表皮生长因子融合基因,克隆入pET22b(+)-X表达载体中,构建重组质粒pET22b-CecropinB-EGF,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami2(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。镍离子亲和层析纯化融合蛋白并复性后,对其促表皮生长活性进行测定,最后在5L发酵罐中进行发酵。结果酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入pET22b(+)-X表达载体中;SDS-PAGE分析显示,天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白在Rosetta-gami2(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量约占全菌总蛋白的30%;Westernblot分析显示,表达产物可与表皮生长因子单克隆抗体特异结合;融合蛋白的表达形式为包涵体;纯化、复性后的融合蛋白具有促BALB/c3T3细胞生长的活性,在5L发酵罐中进行发酵,1次可收获菌体约60g。结论已成功地在大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中表达了天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,为研究具有抗菌和促伤口愈合的双功能药物奠定了基础。     

蜂毒明肽的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化蜂毒明肽。方法人工合成蜂毒明肽基因,与肠激酶识别序列基因串联,插入原核表达载体pGEX-2T中,构建蜂毒明肽与谷胱甘肽硫转移酶的融合表达载体pGEX-APAM。将重组质粒转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并进行纯化和肠激酶切割。结果经Western blot鉴定,表达产物具有良好的反应原性。在优化的表达条件下,融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的25.8%,且大部分以可溶性形式存在。纯化的融合蛋白纯度大于95%,每毫克融合蛋白经肠激酶切割后,可得蜂毒明肽58.5μg,回收率为81.9%。结论已成功地原核表达并纯化了蜂毒明肽。     

多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白的原核表达及其生物活性

目的原核表达多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法应用PCR法扩增Arg9-VP3序列,与载体pET-43.1a连接后,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA纯化后,进行肠激酶裂解、超滤浓缩,并检测其生物活性。结果重组表达质粒pET-43.1a-Arg9-VP3经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确。转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达。纯化的融合蛋白纯度达90%以上,可抑制HeLa细胞增殖。结论已成功地在大肠杆菌中表达了多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白,纯化的融合蛋白具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

HPV16 MuE6/E7嵌合蛋白的原核表达、纯化及其免疫效果

目的表达HPV16型MuE6/E7嵌合蛋白,并检测其免疫原性及抗肿瘤活性。方法将构建的重组MuE6/E7蛋白的表达载体转化大肠杆菌BL21(λDE3)进行诱导表达,表达的包涵体蛋白经分离、纯化、变性及复性后,通过离子交换和分子筛层析进行纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE、Western blot、HPLC和质谱分析鉴定,并免疫C57BL/6小鼠,检测其免疫原性和抗肿瘤活性。结果重组MuE6/E7蛋白相对分子质量约为21 000,表达量约为23.06%,表达形式为包涵体,经复性、纯化后,纯度达97.17%。免疫3针后,小鼠可产生高滴度的HPV特异性抗体,并且与注射剂量呈正相关。免疫小鼠能抵抗TC-1肿瘤细胞的攻击,并可延长TC-1致瘤小鼠的存活期。结论已表达并纯化了重组MuE6/E7蛋白,其对TC-1致瘤小鼠具有一定的免疫治疗作用,为进一步研制HPV治疗性疫苗奠定了基础。     

重组猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

目的原核表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行分析。方法通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF2编码382~674位氨基酸序列的基因片段,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-293表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA层析柱纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定。结果成功扩增到904bp的目的基因。重组载体pET28a-293经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确。SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量与预期相符,表达量可占菌体总蛋白的66.15%。Western blot分析表明目的蛋白具有较好的反应原性。ELISA试验证实目的蛋白能与阳性猪源和标准HEV血清发生反应。结论已成功构建了猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的pET28a-293原核表达载体,并得到了有效表达,为进一步建立猪源戊型肝炎的诊断方法奠定基础。     

人Bid蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人Bid基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人Bid基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到588bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid经双酶切鉴定和测序表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约48000,表达量约占菌体总蛋白的50%,纯化后纯度可达97%。结论已成功克隆并原核表达了人Bid基因,得到纯度较高的Bid蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。