克氏原螯虾营养需求研究进展

对克氏原螯虾天然饵料、蛋白质需求和脂肪需求三个方面逐一介绍了克氏原螯虾营养需求的研究现状。     

克氏原螯虾虾头酶解工艺的研究

对克氏原螯虾虾头制取调味料的主要工艺参数进行了研究,同时优化了酶解液脱腥臭配方.确定出最佳水解酶为碱性蛋白酶,最佳酶解的条件为:水解时间1.5h、水解温度65℃、酶与底物比1750U/g、起始pH10.0、固液比1:1,在此条件下,水解率可达41.26%;酶解液脱腥臭最佳配方为:去腥剂为酵母粉,去腥时间为1h,去腥剂质量分数为0.5%,去腥温度为40℃.去腥效果最佳.水解液具有浓郁的虾风味,为调味料较好的基础原料.     

克氏原螯虾虾头酶解工艺的研究

对克氏原螯虾虾头制取调味料的主要工艺参数进行了研究,同时优化了酶解液脱腥臭配方。确定出最佳水解酶为碱性蛋白酶,最佳酶解的条件为:水解时间1.5h、水解温度65℃、酶与底物比1750U/g、起始pH10.0、固液比1:1,在此条件下,水解率可达41.26%;酶解液脱腥臭最佳配方为:去腥剂为酵母粉,去腥时间为1h,去腥剂质量分数为0.5%,去腥温度为40℃,去腥效果最佳。水解液具有浓郁的虾风味,为调味料较好的基础原料。      

超声波提取克氏原螯虾壳中虾青素

以克氏原螯虾壳为原料,采用超声波辅助方法提取虾青素,探讨了提取剂种类、超声作用时间、超声波功率、料液比等因素对虾青素提取效果的影响。应用Box-Behnken中心组合实验和响应面分析法确定了克氏原螯虾壳中虾青素提取最佳条件为超声作用时间29.4 min、超声波功率163 W、料液比为1:18.2(g:mL),此条件下虾青素含量为62.52μg/g。     

克氏原螯虾螺原体病原的发现及诊断研究

作为一种原核微生物,螺原体个体微小、形态多为螺旋状且不含细胞壁,大多存在于植物、昆虫中。近些年发现一种新型螺原体,会造成中华绒螯蟹的"颤抖病",且对其他水生甲壳动物都表现出广泛的侵染性,如克氏原螯虾。于此,寻找一种反应灵敏的定量方法防治中华绒螯蟹"颤抖病"成为当前的研究热点。明确螺原体在克氏原螯虾体内的增殖规律,能够完善水生甲壳动物螺原体疾病的监管,也将有助于其他淡水甲壳类动物螺原体流行病学的研究。     

酶法提取克氏原螯虾头和虾壳的中蛋白质

采用蛋白酶法对克氏原螯虾头和虾壳中蛋白质的提取工艺进行研究。单因素试验和正交试验结果表明:虾头和虾壳中蛋白质提取的最优工艺条件为木瓜蛋白酶与风味蛋白酶按1:1.5混合作为复合蛋白酶,酶解温度为50℃、酶解时间为3h、蛋白酶用量为1.0%、pH6.5、料液比为1:10,该条件下蛋白质提取率为54.22%。     

不同捕捞月份和规格克氏原螯虾品质比较

对2020年4~6月和3种规格（S:10~20 g、M:20~30 g、L:30~40 g）的克氏原螯虾虾肉营养成分、得率、持水性、质地和微观结构进行分析比较。结果表明:在4~6月,虾肉水分含量随着捕捞月份推移呈下降趋势,5月三种规格的克氏原螯虾虾肉灰分含量最高,6月S组蛋白质含量最高,4月L组粗脂肪含量最低。虾仁得率随着规格和月份的推移而下降。虾肉pH主要呈中性（7.09~7.22）。L组的持水性随采样月份的增加而下降,S与M组呈先下降后上升的趋势。随样品规格的增大,虾肉表面硬度逐渐减小,内部硬度显著上升（P<0.05）,S组虾肉弹性随月份先显著上升（P<0.05）后变化不显著,M与L组的弹性变化不大。肌纤维间隙大小与持水性相对应,6月L组的肝小体之间间隙最小。相关性分析结果表明,克氏原螯虾虾仁得率越低,肌纤维之间间隙越小,虾肉越Q弹,营养越丰富。本研究为不同采样月份与规格的克氏原螯虾商业化研究提供数据支持。     

江苏淮安地区克氏原螯虾的重金属污染调查与分析

目的 对淮安五个地区的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)体内As、Hg、Pb、Cd四种重金属污染情况进行检测分析。方法 2011年7~10月分别从淮安市五个区县的克氏原螯虾养殖场采集成品虾样品48批次, 用原子荧光分光光度计和原子吸收光谱仪对样品进行检测, 并采用单因素污染评定方法对该地区克氏原螯虾重金属污染水平进行评定。结果 检测结果表明, 淮安地区克氏原螯虾四种重金属都未超出安全限量范围。结论 淮安地区人工养殖的克氏原螯虾抽查未见As、Hg、Pb、Cd的污染, 即淮安地区人工养殖的克氏原螯虾没有受到重金属As、Hg、Pb、Cd的污染。     

克氏原螯虾新型过敏原血蓝蛋白的鉴定及性质研究

以克氏原螯虾为研究对象,鉴定血蓝蛋白的理化性质及其过敏原性。酶联免疫吸附试验结果表明:6份甲壳类过敏患者血清与克氏原螯虾血淋巴发生特异性IgE反应,利用离心和柱层析方法从血淋巴中分离纯化到目的蛋白。SDS-PAGE分析显示纯化的目的蛋白由6个亚基(依次为68,72,76,82,84和88 ku)组成,采用兔抗凡纳滨对虾血蓝蛋白多克隆抗体的免疫印迹试验证实目的蛋白为血蓝蛋白。免疫印迹试验结果显示,纯化的血蓝蛋白与甲壳类过敏患者血清出现了特异的杂交显色条带,表明血蓝蛋白具有IgE结合活性。与克氏原螯虾主要过敏原(原肌球蛋白)相比,血蓝蛋白的糖含量为1.99%,热稳定性好,pH稳定性及对胃蛋白酶的耐受性不如原肌球蛋白,但比原肌球蛋白更耐胰液消化。综合血清学及理化性质分析结果,提示血蓝蛋白是克氏原螯虾的1种新型过敏原。     

木瓜蛋白酶水解克氏原螯虾虾壳提取虾青素的研究

研究以克氏原螯虾壳为原料,利用木瓜蛋白酶对其水解提取虾青素,通过单因素试验和中心点实验设计试验优化最佳酶解工艺条件。结果表明,酶解最适条件为:酶解温度48.5℃、pH值5.8、酶活力为2 522U/g、水解时间63min、配液与底物固比2∶1(g∶mL),每克湿虾壳含总类胡萝卜素115.76μg,比用酸处理法提取量提高13.82%。高效液相检测其虾青素质量浓度达到13.06g/dL,显著提高了萃取物中虾青素浓度,为虾的废弃物的综合利用提供了新的途径。     

裂殖壶菌鲨烯合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

为探讨裂殖壶菌烯合酶基因的克隆,以及在大肠杆菌中的表达。采用简并引物与RACE 相结合的方法从裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)中克隆出鲨烯合酶基因。分析表明该基因的cDNA 全长包括1672 个核苷酸,编码一个含446 个氨基酸的开放阅读框;在裂殖壶菌中以单拷贝的形式存在。同源分析显示裂殖壶菌鲨烯合酶的氨基酸序列中含有5 个保守基序。将裂殖壶菌鲨烯合酶的cDNA 序列连接到原核表达载体pGEX-4T-3 上构建融合表达载体,并在大肠杆菌BL21 中进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE 及Western blotting 分析结果显示,诱导表达出的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,其相对分子质量与预期相符;且融合蛋白具有一定的免疫原性。     

乳酸片球菌R-4细菌素PA-1原核表达及其理化特性

为实现原核表达产出细菌素并检测其理化特性,作者将乳酸片球菌 R-4细菌素pedA基因进行扩增回收,与pMD19-T载体连接后转入E.coli DH5α感受态细胞进行克隆。提取克隆后的pedA基因与表达载体pET-32a（+）连接,形成重组质粒pET-32a-pedA并转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,乳酸片球菌R-4细菌素PA-1在大肠杆菌细胞进行表达。表达蛋白质经Ni-NTA柱纯化后,以金黄色葡萄球菌为指示菌检测其理化特性。结果表明,在E.coli BL21(DE3)细胞中成功表达相对分子质量为26 000的乳酸片球菌R-4细菌素PA-1并完成纯化。纯化后的乳酸片球菌R-4细菌素PA-1在40~121 ℃作用20 min、在pH 2~12、紫外线照射0~10 h、过氧化氢酶作用2 h后,其抑菌范围分别为14.7~15.6 mm、14.0~16.5 mm、15.1~15.8 mm和14.9 mm,而分别经胃蛋白酶和胰蛋白酶作用2 h均失去抑菌作用。这表明乳酸片球菌R-4细菌素PA-1对高温、强酸强碱、紫外线和过氧化氢酶均具有较好的稳定性,而胃蛋白酶和胰蛋白酶会使其失活。     

中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05 α-淀粉酶基因的克隆和原核表达

本实验室从新疆盐湖分离得到一株产α-淀粉酶中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05,根据已报道的α-淀粉酶基因(α-AMY)序列的保守区域设计引物,从中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05基因组中扩增出α-淀粉酶基因片段,将α-淀粉酶基因纯化后克隆到pGM-T载体上测序,结果表明α-淀粉酶基因片段长约1500bp,与地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的α-淀粉酶基因序列的同源性为95%,两种序列具有一定的同源性。按正确的阅读框架将α-淀粉酶基因片段定向克隆到表达载体pET-32a上,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳表明,α-淀粉酶基因能在大肠杆菌BL21中成功表达,确定表达蛋白的相对分子量为61kD左右,与理论推导的分子量相一致;构建的大肠杆菌工程菌,所产生的α-淀粉酶是包涵体,通过超声波粉碎仪粉碎后,测α-淀粉酶酶活为原菌的1.8倍。     

芽胞杆菌XM-1酸性α-淀粉酶基因的克隆及原核表达

为使枯草芽胞杆菌XM-1菌株酸性α-淀粉酶基因高通量表达,提高酶产量,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出该酶基因As-Amy,并构建pET30a(+)/As-Amy原核表达载体,在大肠杆菌BL21中成功表达。测序结果表明As-Amy基因编码框全长为1434bp(Genbank登录号GQ153530),编码477个氨基酸,预测蛋白质分子质量为61ku。序列比对分析表明,As-Amy与多个枯草芽胞杆菌α-淀粉酶基因相似性在98%以上,所编码氨基酸与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis natto)IAM1212同源性最高。SDS-PAGE分析显示,As-Amy基因在大肠杆菌BL21中获得表达,酶活力较原菌株XM-1提高了2.7倍,表达蛋白分子质量大小与预测值相符。     

根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、 结构预测及原核表达

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶能够催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。为实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的异源表达,设计引物,克隆并分离其序列,通过生物信息学软件分析D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DNA和蛋白质的结构特点。结果表明,该基因开放阅读框870bp,编码289个氨基酸;蛋白质二级结构中α-螺旋占38.41%,β-折叠占47.06%,无规则卷曲占14.53%;该蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,定位于细胞膜;构建原核表达载体并导入E.coliBL21宿主中,表达的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶分子质量约为33kDa,1mmol/LIPTG诱导E.coliBL21重组菌28h后,目的蛋白表达量和酶活分别为0.32g/L和3.8U/mL。根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因能够在大肠杆菌中实现表达。     

维氏气单胞菌来源几丁质酶的克隆表达及应用

丰年虾是一种小型甲壳类动物,孵化后的幼虫是水产动物的优质饵料,残留的卵壳则作为废弃物处理.然而丰年虾卵壳含有丰富的蛋白质和几丁质,具有极大的应用潜力.为了从丰年虾卵壳中制备几丁寡糖,选择了水解产物分布宽泛和含有几丁质结合域的维氏气单胞菌来源的几丁质酶ChiB565,将其在毕赤酵母Pichia pastoris中进行重组...     

人源β-N-乙酰葡糖胺转移酶I（h-GnT-I）的原核表达与活性鉴定

-β--N-乙酰葡糖胺转移酶I（-h-GnT-I）功能为在高尔基体中向糖蛋白上的N-寡糖M5GN2结构添加一个-β--1,2 连接的N-乙酰葡糖胺。为大量获得具有活性的-h-GnT-I蛋白,构建了重组表达质粒pET28a-MGAT1?驻TM并将其在大肠杆菌Rosetta菌株中表达。对诱导条件进行优化后,将获得的可溶性重组蛋白His-hGnT-IΔTM进行镍柱亲和纯化并通过高效液相色谱（HPLC）检测其体外活性和底物特异性。结果表明,大肠杆菌ROSETTA体系可以成功表达可溶性重组hGnT-I蛋白;该蛋白质相对分子质量约为42 800,在体外反应中具有相应的糖基转移酶活性;除天然糖链底物M5GN2外,该蛋白质可以识别非天然糖链底物M3GN2;产物经酶切反应验证,证明该蛋白质催化添加一个β糖苷键连接的N-乙酰葡糖胺的反应。本研究所开发的原核表达体系可以大量制备纯化的功能性重组hGnT-I蛋白,以应用于该蛋白质的性质研究以及N-糖链的体外合成。     

酿酒酵母和大肠杆菌鸟嘌呤脱氨酶基因的克隆、原核表达及活性测定

与植物体内合成路径不同,微生物体内合成咖啡碱存在一条以黄嘌呤为底物,利用鸟嘌呤脱氨酶催化鸟嘌呤生成黄嘌呤有效合成咖啡碱的新途径。为克隆鸟嘌呤脱氨酶的基因,构建可高效合成黄嘌呤的原核表达载体并对外源蛋白活性进行检测,分别以酿酒酵母和大肠杆菌为研究材料,根据GenBank中酿酒酵母和大肠杆菌中鸟嘌呤脱氨酶基因gud1和egud序列设计引物,聚合酶链式反应特异扩增其基因片段,将目的基因连接至pMAL-c5X载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）中诱导蛋白表达,并用高效液相色谱法鉴定其目的蛋白的催化活性。结果表明重组载体pMAL-gud1、pMAL-egud均可用来合成黄嘌呤,且GUD1比EGUD合成黄嘌呤的效率更高。研究结果将进一步丰富黑茶加工技术理论,同时为体外构建高效咖啡碱生物工程菌提供理论支持。