谷氨酸脱羧酶基因的挖掘、表征及全细胞制备γ-氨基丁酸的研究

γ-氨基丁酸是一种重要的生物活性因子,通过谷氨酸脱羧酶（GAD）使L-谷氨酸脱羧而合成。作者首先将酿酒酵母谷氨酸脱羧酶基因进行克隆并实现其在大肠杆菌中表达。通过亲和层析纯化获得了比活力高达66.55 U/mg的重组酶ScGAD。进一步酶学性质分析结果表明,ScGAD最适反应温度为60 ℃,最适反应pH 为4.0,且在30~50 ℃、pH 4.0~9.0时表现出优越的稳定性;其动力学参数Km为14.28 mmol/L,对L-谷氨酸具有较好的亲和力。最后通过全细胞制备γ-氨基丁酸（GABA）的最适条件探究,得到GABA生成效率最高的条件为60 ℃、pH 4.0,在此条件下,100 mmol/L底物L-谷氨酸经全细胞催化可合成GABA 35.9 g/（g·h）。该研究为GABA高效生产提供依据。     

产GABA乳酸菌菌种筛选及其谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究

从现有的商业乳酸菌菌种中筛选出产GABA的菌种,进而对其生长曲线及所产谷氨酸脱羧酶的酶学性质进行了研究。结果表明:该菌种接种时选择种龄为16 h的菌种较为合适,该菌种的谷氨酸脱羧酶的酶活受温度、pH和酶浓度影响较大。最适温度为40℃,在最适温度左右酶的稳定性最好,最适pH为4.5,在pH4.0~5.0时有较高的酶活力,酶浓度不断增大时,酶活上升趋势逐渐变缓。这为利用该乳酸菌进行发酵产GABA的工艺研究提供了参考依据。     

普鲁兰酶N467G突变体的酶学性质分析

在淀粉制糖工业中,普鲁兰酶通常与糖化酶配合使用,其在酸性pH和较高温度下的催化活力是影响淀粉脱支效率的主要因素。该研究通过对长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)普鲁兰酶蛋白质解折叠自由能的差值(ΔΔG)的计算预测和突变位点稳定性分析,选择突变位点并进行定点突变,获得突变体N467G。与野生型普鲁兰酶分子相比,突变体N467G的最适作用温度提高至60℃,最适作用pH降低至4.5;其在60℃条件下孵育2.5 h或在pH 3.5~5.5孵育1 h残留酶活力均保持在80%以上,稳定性明显提高。此突变体的获得为其后续高效表达与工业化应用奠定了重要基础。     

突变酶Y93S对嗜热地衣芽孢杆菌SR01葡聚糖酶热稳定性的影响

为提高嗜热地衣芽孢杆菌SR01葡聚糖酶的热稳定性,对其相关的氨基酸残基进行定点突变改造。通过对其结构的分析,构建了Y93S突变体,利用分子动力学模拟分析评估后,发现Y93S突变体可能具有较高的耐热能力,利用定点突变技术构建Y93S表达载体并分析温度对表达产物酶活的影响。试验结果表明,突变酶Y93S的最适温度由野生型酶的55 ℃提高至70 ℃;在90 ℃条件下,突变酶Y93S较野生型酶的半衰期由60 min提高到120 min以上;pH及pH稳定性较野生型变化不明显。突变酶Y93S极大的提高了野生型酶的热稳定性,具有潜在的工业应用价值,同时为葡聚糖酶的耐热机理提供有力依据。     

乳酸菌谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究

本文对一株乳酸菌所产谷氨酸脱羧酶的酶学性质进行了较系统的研究,其中包括酶的热稳定性、pH稳定性及温度、pH和一些化学物质对酶活的影响。结果表明:此酶的最适温度为52℃,最适pH为4.5,米氏常数Km=24mmol。PLP、VB6及Ca2 在一定程度上都能促进酶活,且在含量小于100μmol时,作用程度为PLP>VB6>Ca2 。乙酸浓度小于0.05mol/L也能提高酶活力。     

赖氨酸脱羧酶分子改造及其催化合成戊二胺

1,5-戊二胺(戊二胺)具有良好的生物活性,广泛应用在农业、医药以及工业等领域。赖氨酸脱羧酶可以催化L-赖氨酸生产戊二胺,为了提高赖氨酸脱羧酶催化合成戊二胺的效率,首先在大肠杆菌中克隆表达了粘质沙雷氏菌来源的赖氨酸脱羧酶(SmcadA)。生化特征表明,SmcadA最适催化pH为6.0,最适催化温度约为40℃。随后对SmcadA的第348位氨基酸进行了突变研究,筛选获得了催化效率显著提高的突变体Gly348Ala,主要原因是该突变导致蛋白中氨基酸残基和底物之间相互作用的氢键数增加,从而影响其催化效率。最后,对重组菌株细胞进行了戊二胺合成研究,催化反应25 h,含有突变体Gly348Ala的重组菌细胞可以催化合成218.2 g/L戊二胺,野生型SmcadA重组菌仅能催化合成159.2 g/L戊二胺。该研究结果为工业化酶催化合成戊二胺提供了借鉴。     

巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶的表达及其酶活性研究

谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)能够催化L-谷氨酸(盐)脱羧反应生成γ-氨基丁酸,它是微生物发酵法生产γ-氨基丁酸的关键酶,具有很高的工业应用价值。本文将来源于巨大芽孢杆菌的谷氨酸脱羧酶(Bm Gad)经克隆至表达载体pET21b后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,并采用亲和层析的方法将该酶纯化后,用比色法测定该酶的酶活性。结果表明,BmGad克隆表达后,采用SDS-PAGE分析可知其相对分子质量约为5.3×10~4 Da。重组蛋白经亲和纯化后,该酶的最适温度为50℃,酶活性达到153U/mg;最适p H为5,酶活性为151 U/mg,在偏中性环境中比较稳定,适合于工业化生产的应用。     

重组羧肽酶原B突变体C383A的纯化与性质研究

目的纯化羧肽酶原B突变体C383A并研究其酶学性质。方法用DEAE-FF离子交换树脂纯化C383A,测定其动力学参数,温度对酶活性的影响、温度稳定性、最适pH以及pH稳定性等酶学性质,并与野生型比较。结果纯化后获得高纯度突变体C383A,与野生型相比,催化效率及稳定性均有提高,但与底物的亲和力降低,随着温度的上升催化速率的增长率低于野生型。结论将重组羧肽酶原B第383位Cys突变为Ala可对酶的性质产生影响,与野生型比较,C383A提高了酶的催化效率及温度和pH稳定性。     

大豆谷氨酸脱羧酶分离纯化及酶学性质研究

对大豆中的谷氨酸脱羧酶(GAD)进行了提取、纯化及酶学性质的研究.采用硫酸铵分级沉淀技术对大豆中GAD进行了纯化,该酶被纯化了4.7倍.纯化后的大豆GAD最适温度为40℃,最适pH为5.9,大豆GAD的热稳定性较差,在80℃几乎失去活性,但该酶在pH5.0～8.0较稳定,能保持很好的酶活.大豆GAD对底物谷氨酸的Km值为19.4 mmol/L.Mg2、KCl对大豆GAD活性影响不大,但KI、Ag+、SDS对大豆GAD有抑制作用.Ca2+对大豆GAD有激活作用,当Ca2浓度为1 500 μmol/L时,对大豆GAD激活作用最强,相对酶活能达到160％.大豆GAD与其他植物GAD相比存在差异,并证实可被Ca2+激活.     

重组羧肽酶原B突变体C383A的纯化与性质研究

目的 纯化羧肽酶原B突变体C383A并研究其酶学性质.方法 用DEAE-FF离子交换树脂纯化C383A,测定其动力学参数,温度对酶活性的影响、温度稳定性、最适pH以及pH稳定性等酶学性质,并与野生型比较.结果 纯化后获得高纯度突变体C383A,与野生型相比,催化效率及稳定性均有提高,但与底物的亲和力降低,随着温度的上升催化速率的增长率低于野生型.结论 将重组羧肽酶原B第383位Cys突变为Ala可对酶的性质产生影响,与野生型比较,C383A提高了酶的催化效率及温度和pH稳定性.     

多糖奈瑟球菌淀粉蔗糖酶突变株F191M的构建及酶学性质表征

目的:通过定点突变提高淀粉蔗糖酶的活力,研究酶学性质表征,为淀粉蔗糖酶的规模化制备和应用提供试验依据。方法:利用基因工程技术,将来源于多糖奈瑟球菌(Neisseria polysacchare)的AS基因在大肠杆菌BL21上异源表达。对F191位点进行定点突变,筛选获得F191M,再对F191M和野生型淀粉蔗糖酶诱导表达和非变性镍柱纯化后进行酶学性质表征。结果:成功构建突变株F191M,该突变株比酶活为202 U/mg,较野生型提高1.44倍。通过对比F191M与野生型酶学性质发现,F191M最适p H值由野生型的7.0提高为8.0,两者最适温度均为35℃,该温度下,F191M半衰期由野生型的20h降低到19h,F191M对金属离子及有机试剂具有更好的抗性。酶动力学研究显示,F191M的Vmax较野生型提高了1.45倍。结论:突变株F191M在大肠杆菌中得到有效表达,活力较野生型提高了1.44倍。     

壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体的稳定性

考察壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体在体外的稳定性。分别从最适pH、最适温度、储存稳定性、酸碱稳定性、热稳定性,以及抗胰蛋白酶水解的能力等方面,对比游离L-天门冬酰胺酶及壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体。结果表明:游离L-天门冬酰胺酶和壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体的最适pH分别为7.5和7.0,最适温度分别为60℃和50℃,壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体的储存稳定性、酸碱稳定性、热稳定性,以及抗胰蛋白酶水解的能力均优于游离酶。因此,壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体能明显提高游离酶的稳定性。     

酱油曲中谷氨酰胺酶酶学特性研究

以酱油曲中的谷氨酰胺酶为研究对象,通过蒸氨法测定谷氨酰胺酶酶活力,探究不同温度、pH、NaCl浓度对谷氨酰胺酶酶活力和稳定性的影响,同时分析了谷氨酰胺酶底物专一性和底物浓度对其的抑制作用。研究结果表明,酱油曲中谷氨酰胺酶最适温度为55℃,在此温度下维持8h,酶活力损失70%以上,酶热稳定性较差;最适pH为7.0,在pH 6.0～9.0范围内均能维持较高的酶活力,pH稳定性优于温度;NaCl对谷氨酰胺酶酶活力具有较强抑制作用,6%NaCl浓度条件下维持4h,酶活力完全被抑制。同时,谷氨酰胺酶也能够水解天冬酰胺,并且高浓度谷氨酸对酶活力没有明显的抑制作用。该研究结果可为酱油中谷氨酸研究提供理论指导。     

提高L-谷氨酸脱羧酶活力的研究

本文主要研究了对L-谷氨酸脱羧酶活力产生影响的几个因素，结果表明培养基配比、培养基初始pH值、大肠杆菌的培养时间及环境温度是影响L-谷氨酸脱羧酶活力的几个关键点，通过实验我们找出了最佳点，使酶活力提升至八分钟左右。     

米黑根毛霉α-淀粉酶的定向进化、高效表达及在面包中的应用

本研究利用定向进化技术对米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)来源的α-淀粉酶(RmAmy)进行分子改造,随后对突变酶进行高效表达和在面包中的应用。突变酶(mRmAmy)的最适pH和温度分别为5.0和65℃,比野生型下降1.0 pH和10℃;该酶在pH 4.0～10.0和60℃以下稳定。mRmAmy经高密度发酵168 h,酶活力最高达11 900 U/mL。mRmAmy应用于面包制作中,在加酶量为3 mg/kg时,面包比容增加14.4%,硬度减小25.8%。结果表明mRmAmy在烘焙工业中具有很大的应用潜力。     

米曲霉木聚糖酶N端引入二硫键对其热稳定性的影响

为提高源自米曲霉Aspergillus oryzae 11家族木聚糖酶(AoXyn11A)的热稳定性,对其相关的氨基酸残基进行定点突变改造。通过对野生型酶AoXyn11A和一种超耐热酶EvXyn11TS的N端氨基酸残基序列进行同源比较,在野生型酶N端引入一个二硫键,获得突变酶AoXyn11AM。野生型酶和突变酶的热稳定性通过同源建模和分子动力学模拟分析评估后,其基因分别在毕赤酵母GS115中进行表达并分析温度对表达产物酶活性的影响。结果表明:突变酶的最适温度由野生型酶的55℃提高至60℃;在50℃和55℃保温30 min,突变酶保留94%和45%保温处理前的酶活性,分别较野生型酶(62.5%和1.4%)有大幅度的提高。突变酶在保留了野生酶其它优良性质的基础上,提高了热稳定性,具有潜在的工业应用价值。     

昆虫来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的酶学性质表征

选取突变体K49R进行分离纯化、酶学性质表征,并进行全细胞催化合成β-丙氨酸,旨在研究红粉甲虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase,ADC)的酶学性质,并为生物法制备β-丙氨酸提供理论与技术支持。突变体K49R最适pH为6. 5,在pH 6. 0～7. 0之间保持稳定;最适温度为42℃,热稳定性较野生型提高1. 7倍;底物亲和力大幅提高,催化效率是野生型的1. 8倍。在培养基中添加10 g/L葡萄糖可以有效提高重组菌的生物量,以及重组酶的可溶性表达量;在全细胞催化合成β-丙氨酸体系中,添加磷酸吡哆醛(pyridoxal-5-phosphate,PLP)可以缩短反应时间,提高催化效率。该研究开发了具有工业化潜力的工程菌,建立了绿色、高效的β-丙氨酸生物合成法,为β-丙氨酸生物合成的产业化奠定了重要基础。     

谷氨酸棒杆菌中谷氨酰胺合成酶的克隆表达及固定化

对谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)来源的谷氨酰胺合成酶进行腺苷酰化位点定点突变,并在大肠杆菌中进行异源表达,得到的重组酶活为6.215 U/mg。分离纯化重组突变酶后,对其固定化条件及固定化酶的性质进行研究。结果得到固定化条件为:以LX-1000EP树脂作为固定载体,载体量0.176 g/U、p H值8.0、温度30℃、吸附时间16 h。固定化酶活力达到3.658 U/g,酶活回收率达到67.17%。重组酶固定化后,反应最适温度没有变化,最适p H略向碱性偏移,储藏稳定性提高,转化谷氨酸生产谷氨酰胺的水平与游离酶相当,对50 mmol/L谷氨酸的转化率为92.83%,为酶法生产谷氨酰胺后续研究提供了参考。     

大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因克隆与表达及其酶学性质

目的:研究大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因克隆与表达及其酶学性质。方法:首先采用PCR技术克隆编码大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因gadA,并将该基因克隆至载体pET-28a(+)中,形成重组质粒pET28a-gadA;然后将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21,构建重组菌株大肠杆菌BL21/pET28a-gadA。进一步采用Ni~(2+)亲和层析色谱分离纯化谷氨酸脱羧酶A,研究其酶学性质。结果:经PCR和双酶切鉴定,重组质粒pET28a-gadA构建成功。SDS-PAGE分析表明Ni~(2+)亲和层析纯化后得到电泳纯级谷氨酸脱羧酶A,其比活力为19 U/mg,得率为12.8%。在pH 4.5时,谷氨酸脱羧酶A的酶活力最高。该酶的最适温度为50℃,且在40℃时有较高的热稳定性,70℃时热稳定性较差,酶活力仅为初始酶活的17.9%。Cu~(2+)对该酶的酶活力有较强的抑制作用,Ba~(2+)、Co~(2+)和Mg~(2+)对其酶活力影响不大,Ca~(2+)能显著增加该酶的酶活力。结论:研究结果为深入理解谷氨酸脱羧酶A的酶学性质及其γ-氨基丁酸的制备提供了试验基础。     

重组草酸脱羧酶的表达及酶学性质研究

研究了重组草酸脱羧酶的表达及其酶学性质。经IPTG诱导,每克湿重菌体收获草酸脱羧酶活力820U,经Ni-NTA亲和层析酶液纯化2.07倍,酶活力回收60.38%。酶促反应的最适温度为50~55℃,最适pH值为3.5,添加EDTA及Fe2+对酶活力有促进作用,Mn2+抑制酶活。在pH4.0,温度37℃下Km值为14.53 mmol/l,Vmax为133.33 U/mg。