接种量对单增李斯特菌生长/非生长界面的影响

在4个水平(10~1,10~3,10~5,10~7 CFU/m L)接种浓度下,通过肉眼观察培养基浊度结合涂布TSA-YE平板,对TSB-YE肉汤中培养的单增李斯特菌在温度(0~30℃)、盐度(0.5%~8.5%)、pH(4.0~7.5)条件下的生长/非生长响应进行测定,结果表明:接种量影响单增李斯特菌生长/非生长界面的位置。通过对各种生长条件下单增李斯特菌生长/非生长数据的分析,用多项式逻辑回归模型,建立单增李斯特菌生长/非生长的界面模型,模型拟合的一致性为83.8%到89.6%,拟合结果较好。接种量对微生物生长的起点有重要影响,为微生物生长受初菌数的影响提供定量分析数据,也为建立实际产品中微生物的生长/非生长界面模型提供参考依据。     

环境因子及接种量对单增李斯特菌生长/非生长界面的影响

单增李斯特菌在实验设定的环境条件下,通过10倍梯度稀释将菌悬液分别稀释到101、103、105、107CFU/m L四个接种水平,然后接种到TSB-YE肉汤中,培养基置于恒温培养箱中进行培养,然后通过肉眼观察培养基浊度并结合涂布TSA-YE平板对其生长/非生长情况进行判定,通过Logistics多项式回归模型对处理的数据建立了单增李斯特菌生长/非生长的界面模型。实验结果表明不同生长温度,p H和盐度的交互作用对单增李斯特菌的生长/非生长界面的影响较大,接种量的大小也会影响单增李斯特菌生长/非生长过渡区域的具体位置,但具体原因和作用机制还有待进一步研究。该研究为抑制单增李斯特菌生长的环境因子条件范围和实际产品中的污染严重程度提供一定的参考依据,对于有潜在单增李斯特菌污染的产品来说,这为加强产品的栅栏因子,优化工艺条件以提高其安全度也提供了重要的参考。     

可生食蔬菜中单核细胞增生李斯特菌生存特征研究

目的 探究可生食蔬菜品种、温度、接种部位对单核细胞增生李斯特菌（以下简称单增李斯特菌）存活的影响,为可生食蔬菜中单增李斯特菌的风险评估和关键控制措施提供理论依据。方法 以冻干定量单增李斯特菌为菌株来源,以彩椒、洋葱、黄瓜、圣女果和生菜5种可生食蔬菜的表面和切面为单增李斯特菌的接种点,在4 ℃、25 °C条件下培养7 d,定期监测每份样本中的单增李斯特菌的菌量,对其生长情况进行分析。结果 单增李斯特菌冻干菌种不同瓶间菌量均匀（F=1.923,P<0.05）,-20 ℃储存28 d后的复苏率为93.3%±4.2%。在4 ℃条件下,除了彩椒表面、黄瓜切面、生菜表面和生菜切面外,单增李斯特菌在其他蔬菜上放置7 d后均未见显著生长（δ<0.5 log₁₀ CFU/mL）。在25 ℃条件下,单增李斯特菌在彩椒、洋葱、圣女果、生菜以及黄瓜切面上均呈现为支持生长［δ为（1.16±0.35）~（2.68±0.18）log₁₀ CFU/mL］。单增李斯特菌在黄瓜切面、生菜表面和切面放置7 d后,菌量仍持续增长,在生菜的表面和切面生长趋势和浓度基本一致。结论 单增李斯特菌在可生食蔬菜上的存活能力与蔬菜种类、表面与切面、储存温度等条件密切相关,温度的控制对降低其在可生食蔬菜中的风险至关重要。生菜和切后的黄瓜作为单增李斯特菌高风险食品,应引起风险评估的重视。     

单增李斯特菌的生长特性及其在冷藏牛奶中的预测模型

通过测定单增李斯特菌菌株在不同培养条件下菌液的OD600值,绘制生长曲线,分析培养基成分、温度、p H、Na Cl浓度、接种量以及转速对单增李斯特菌生长的影响,并选取Gompertz方程、Logistic方程和Hill方程建立单增李斯特菌在冷藏牛奶中的生长模型。结果表明:菌株在TSB-YE和MRS培养基中生长良好;能够耐受0.5%~3%的Na Cl浓度范围;最适生长温度为37℃,最适生长p H为8,对氧气的需求量表现不明显。菌株可在4℃冷藏的全脂牛奶中缓慢生长,达到稳定期的菌数有2 lg CFU/m L的增长,Gompertz和Logistic方程模型可用于预测其生长情况。     

鲜切结球莴苣中单增李斯特菌生长预测模型的建立

为建立不同温度下鲜切结球莴苣中单增李斯特菌生长模型,将单增李斯特菌接种到鲜切结球莴苣表面,并于不同温度下贮藏,获得其在4、8、16、24和32℃下的生长数据,选用Gompertz模型进行拟合,建立初级生长模型。在此基础上建立二级模型研究温度对初级模型中单增李斯特菌生长动力学参数的影响,并进行数学检验。结果表明,对最大比生长速率和延滞时间建立平方根模型,结果呈良好的线性关系,相关系数R2分别为0.977 2和0.984 7,所建立的预测模型能很好地描述不同温度下单增李斯特菌的生长动态。     

干燥型荧光PCR试剂盒检测食源性致病菌研究

目的研究干燥型荧光PCR试剂盒检测副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌3种食源性致病菌的灵敏度、特异性和检测人工污染样品情况。方法目标菌和非目标菌接种至血平板, 36℃培养过夜,目标菌比浊至0.5 McF(麦氏单位), 10倍连续稀释后提取DNA,进行灵敏度研究;非目标菌直接提取DNA后检测,进行特异性研究;用高、中、低3个浓度目标菌液人工污染食品样品,按国标方法培养后用干燥型荧光PCR试剂盒检测。结果副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌的最低检测浓度分别为140、380和7900 CFU/mL。3种目标菌人工污染食品样品的最低检测浓度分别为1.2 CFU/25 g、5.1CFU/25 g、10 CFU/25 g。每种试剂盒仅对目标菌株的检测结果呈阳性,非目标菌株均呈阴性。结论新型干燥型荧光PCR检测试剂盒具有较好的灵敏度和良好的特异性,适用于食品中副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌的检测。     

生鲜猪肉中单增李斯特菌动态生长预测与数值模拟

构建生鲜猪肉中单增李斯特菌的动态生长预测模型。猪肉样品接种由3 株单增李斯特菌制备的混合菌液,并置于3 组波动温度（1～45 ℃）条件下培养,采用一步法对获得的生长数据进行分析,构建并比较由初级模型（Baranyi或Two-compartment模型）与二级模型（Cardinal模型）集成的组合模型。结果表明,Baranyi-Cardinal和Two-compartment-Cardinal模型均适合用于描述猪肉中单增李斯特菌的生长,由两者估计的猪肉样品中单增李斯特菌最低、最适、最高生长温度分别为0.94、38.37、45.36 ℃和1.03、37.96、45.58 ℃,最适生长速率分别为0.891 h－1和0.858 h－1,最大生长浓度分别为9.07（lg（CFU/g））和9.09（lg（CFU/g））;通过另设的4 组动态生长实验和3 组等温（4、20、37 ℃）生长实验对模型进行验证,分析表明,模型可以准确预测动态及等温条件下的单增李斯特菌的生长,预测曲线的均方根误差介于0.13～0.48 （lg（CFU/g））,残差服从均值为－0.02 （lg（CFU/g））、标准差为0.29（lg（CFU/g））的正态分布。最后,基于构建的模型开展生鲜猪肉家庭冰箱冷藏过程中单增李斯特菌的生长数值模拟,以证明模型潜在的应用性。本研究结果可用于猪肉中单增李斯特菌的生长预测及风险评估。     

单增李斯特菌RT-LAMP快速检测方法的建立

建立一种可快速检测单增李斯特菌的反转录-环介导等温扩增方法。针对单增李斯特菌的李氏溶血素基因(hly)设计多组引物,经引物筛选和配比优化,建立检测单增李斯特菌的实时荧光RT-LAMP方法,并通过菌株特异性、灵敏度和人工污染脱脂乳样品中的检出限对该方法进行评价。该方法特异性良好, 26株菌株中仅三株单增李斯特菌检出阳性;检测灵敏度高,对单增李斯特菌的菌悬液灵敏度为10~1 CFU/mL,是RT-qPCR方法检测灵敏度的10倍。人工污染样品直接检测的检出限为10~3 CFU/mL,而对样品增菌16 h后,单增李斯特菌的检出限提高到10~0 CFU/25 mL。所建立的RT-LAMP方法可以快速、准确地检测单增李斯特菌,操作简便,适合应急和现场监测使用。     

实时RT-PCR检测存活于乳中的单核细胞增多性李斯特菌

单增李斯特菌是一种可在低温下生长、能引起人畜共患病的食源性致病菌.为克服传统PCR检测的假阳性问题,有效的检测单增李斯特活菌,本研究提取单增李斯特菌的总RNA并进行反转录,以单增李斯特菌的必要毒力基因hlyA为靶基因,设计特异性引物和TaqMan探针进行实时PCR检测,研究了检测的特异性和灵敏度,考查了对人工污染牛乳进行检测的应用性.结果表明,所用引物和探针能较好的扩增目的基因,而对其他食源性致病菌无交叉反应.单增李斯特菌经1h增菌,可检出3×102CFU/ml.而经3h增菌,活菌检测限可达30CFU/ml.人工污染牛乳样品经6h增菌,检测限为17CFU/ml.此方法可应用于乳中单增李斯特菌的快速检测和污染状况调查.     

冷却猪肉中单增李斯特氏菌生长动力学模型的建立与评价

为建立冷却猪肉中单增李斯特氏菌的生长动力学模型,把单增李斯特氏菌接种到无污染的冷却猪肉中,分别放置于2、15、28℃条件下贮藏,分别测定其在不同贮藏时间的菌数。应用修正的Gompertz 方程描述单增李斯特氏菌在2、15、28℃下的生长动态,建立不同温度下其在冷却猪肉中的生长曲线和模型。温度对最大比生长速率(μmax)和延滞时间(λ)的影响,采用平方根模型在0～30℃范围内呈现较好的线性关系,R2 分别为0.7164 和0.9717。模型残差值的绝对值均小于0.03,在“零”上下浮动,表明该模型描述的温度与μmax 和λ(的关系是完全可信的,说明用平方根模型能很好的描述不同温度对单增李斯特氏菌生长的影响。     

不同增菌液对单增李斯特菌的增菌效果比较

目的比较不同选择性增菌液对单增李斯特菌增菌效果及对干扰菌的抗干扰性。方法参考国标GB/T 4789.30-2016和国际ISO 11290-1-2017,将2种来源的单增李斯特菌(标准菌株、分离菌株)和2种干扰菌(大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌)分别接种到4种不同增菌液中,观察增菌后菌液的生长情况。结果研究发现低浓度菌液(102数量级), Fraser肉汤对单增李斯特菌的增菌效果及抗干扰性优于LB肉汤。选择性添加剂浓度过高会抑制李斯特菌的生长,通过选择合适的选择性添加剂及改变添加剂的浓度可以提高检出率。结论在实验室日常检验过程中,需考虑样品类别,选择合适的培养基。提高检测的准确率。     

基于LAMP技术检测速冻肉糜类制品中单增李斯特菌的增菌方法研究及应用

本研究比较四种增菌培养基（Fraser、Half Fraser、LB₁、LB₂）对速冻肉糜类制品中单增李斯特菌的增殖效果,评价其对速冻肉糜类制品中单增李斯特菌LAMP检测检出限的影响,并将优化后的增菌条件结合LAMP技术应用于人工污染样本和实际生产线样本检测。结果显示,四种增菌培养基中Half Fraser的增菌效果最好,在6 h内实现单增李斯特菌活菌数从6.4×101 CFU/mL 增菌至9.4×104 CFU/mL。结合优化增菌条件后,LAMP检测速冻肉糜类制品中单增李斯特菌的检出限从6.4×104 CFU/g（未增菌）降低至6.4×101 CFU/g。利用人工污染单盲样本以及生产线实际样本验证方法的可靠性,结果显示增菌结合LAMP方法与国标法结果一致,准确度100%。该方法样本处理、检测、结果判定总时间控制在8 h内,能够满足企业现场检测需要。     

波动温度条件下生鲜三文鱼中单增李斯特菌生长预测模拟

本研究旨在构建波动温度条件下三文鱼中单增李斯特菌的生长预测模型。将3株从三文鱼中分离的单增李斯特菌混合接种至无菌三文鱼样品,开展连续波动温度(1~35 ℃)条件下的生长试验。采用动态一步法对其中3组生长数据进行分析,构建包含初级模型(Huang模型、Baranyi和Two-compartment模型)与二级模型(HSR模型)的联合模型。结果表明:Huang-HSR模型、Baranyi-HSR模型和Two-compartment-HSR模型具有同等的拟合效果,由其预测的单增李斯特菌最低生长温度分别为 0.51,1.21,1.20 ℃,最大生长浓度分别为9.41,9.35,9.36 lg(CFU/g)。基于模型对迟滞期的定义以及模型表达式的简洁程度,建议选择Huang-HSR模型来描述三文鱼中单增李斯特菌的生长。通过另设的波动温度生长试验及文献报道的恒定温度生长数据对Huang-HSR模型进行验证,波动温度和恒定温度生长数据的均方根误差(RMSE)分别在0.29~0.59 lg(CFU/g)和0.28~0.85 lg(CFU/g)范围,表明该模型适用于描述三文鱼中单增李斯特菌的生长行为。将构建的模型用于正弦波动温度条件下单增李斯特菌的生长模拟,以展示其潜在应用价值。本研究构建的数学模型可用于三文鱼中单增李斯特菌的动态生长预测。     

环介导等温扩增技术快速检测肉中单增李斯特菌

通过建立的环介导恒温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)方法以达到肉中单增李斯特菌快速、灵敏的检出。以特异性的hly A毒力基因作为靶基因,与6株非单增李斯特菌进行特异性试验,同时对不同培养浓度的单增李斯特菌进行了LAMP和PCR方法的灵敏度比较,进而应用LAMP法检测人工污染肉中的单增李斯特菌。结果表明:纯培养物中单增李斯特菌LAMP检出限为8.8×10~0CFU/m L,其灵敏度比普通PCR高100倍;在人工污染肉中单增李斯特菌的检出限为8.8×10~1CFU/m L,在1h内即可完成扩增反应。LAMP方法具备快速、特异、简单、灵敏度高等优势,在食品基质中单增李斯特菌的检测方面具有较好的应用前景。     

超高压协同温度处理对烟熏火腿中单增李斯特菌生长预测模型的建立

为了建立超高压协同温度处理烟熏火腿中单增李斯特菌生长预测模型。本研究分别以20、30、40、50℃结合600MPa对接种106cfu/g单增李斯特菌烟熏切片火腿进行5min的超高压处理,4℃贮藏条件下,每10d测定处理后样品中单增李斯特菌的数量。结果表明:当超高压协同处理的温度高于40℃时显著延长了单增李斯特菌在烟熏火腿修复生长的延滞期,所得生长曲线用修正的Gompertz模型进行了拟合,在35、45d进行验证,建立了烟熏火腿中单增李斯特菌在超高压协同温度处理后的生长预测模型,经验证其精确因子(Af)、偏差因子(Bf)、根平均方差(RMSE)和决定系数(R2)均在较好范围内,能较好的模拟单增李斯特菌的生长情况,为低温肉制品中单增李斯特菌的控制提供理论参考。     

荧光免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速检测单增李斯特菌

为建立单增李斯特菌简单快速、灵敏度高和特异性强的检测方法,本研究以抗单增李斯特菌单克隆抗体偶联磁珠制备免疫磁珠;以羧基荧光微球标记的抗单增李斯特菌多克隆抗体及鼠IgG为标记抗体,抗单增李斯特菌多克隆抗体和羊抗鼠二抗分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条。将免疫磁珠分离与荧光免疫层析法相结合应用于单增李斯特菌的现场快速检测中。结果表明:荧光免疫层析试纸条对纯培养单增李斯特菌的检测限为4×105CFU/mL,联合检测方法10倍、100倍浓缩时,检测限分别为4×104CFU/mL和1×104CFU/mL。联合检测体系特异性较好,与实验室保存的10株细菌无交叉反应。人工污染样本检测限为1×104CFU/mL,同纯培养物相比检测灵敏度并没有降低。本方法的建立对于食品中单增李斯特菌的现场快速检测具有重要意义。     

多重荧光定量聚合酶链反应法检测肉制品中的3种食源性致病菌

摘要：目的 建立多重荧光定量聚合酶链反应法（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）快速检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7 3种食源性致病菌的方法。方法 根据沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌的hemolysin基因、大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列分别设计特异性引物及探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌多重qPCR方法。结果 该方法只扩增3种靶细菌,对其他供试菌不扩增;沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的检出限分别为101、102、102拷贝数/μL,并且拥有良好的重复性和特异性。人工污染的猪肉样品经SLE（Salmonella、Listeria monocytogenes and Escherichia coli 3种菌株的共增菌培养基）培养基富集8 h后,分别可以检测到初始菌液浓度为1.56×102 CFU/25 g的沙门氏菌,2.13×102 CFU/25 g的单增李斯特菌,2.32×102 CFU/25 g的大肠杆菌O157:H7。结论 所建立的多重qPCR灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H7 3种食源性致病菌,在提高食品安全和保护人类健康方面有重要意义。     

添加扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法的建立与应用

以单增李斯特菌inl A基因为靶基因,设计一对特异性引物,以16S rRNA为扩增内标对照,建立了一种含有扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法。优化了PCR反应体系,并对PCR检测方法的特异性、灵敏度、人工污染样品及食品样品检测效果进行了测试。对2株单增李斯特菌、1株英诺克李斯特菌以及19株非李斯特菌菌株进行PCR检测,结果显示,只有2株单增李斯特菌能被检出大小为826 bp的特异性片段,其余20株细菌只能检出1 500 bp的扩增内标片段。灵敏度实验结果显示,基因组DNA和纯培养物的最低检出限分别为1.80×10~2fg/μL和1.21×10~2CFU/m L。当人工污染牛乳样品中单增李斯特菌在最低接种量为0.48 CFU/m L时,经8 h增菌培养后可被该方法检出。采用该研究建立的检测方法对36种食品样品进行检测,证实了该检测方法可以指示检测过程中出现的假阴性现象。综上所述,该研究建立的PCR检测方法能特异性的检测单增李斯特菌,并可有效排除检测过程中出现的假阴性现象,提高检测的准确性。     

散装熟肉制品中单增李斯特菌污染状况分析

目的分析散装熟肉制品中单增李斯特菌污染状况。方法根据GB 4789.30-2016《单核细胞增生李斯特氏菌检验》规定的方法对散装熟肉制品的加工用原料、生产环境、各加工环节中产品以及不同销售环境下产品中的单增李斯特菌进行定性和定量检测。结果原料肉的总体带菌率达到21%;生产环境中第三区(远离食品接触面的区域)检出率为2%,其余区域未检出;各加工环节中产品单增李斯特菌检测结果均小于10CFU/g;不同销售环境下产品中单增李斯特菌检测结果小于10 CFU/g的比例为93%,处于10～50 CFU/g之间的样本占比6%,大于50 CFU/g的占比为1%。结论原料散装熟肉制品中单增李斯特菌污染的主要来源,蒸煮等加工环节能有效地杀灭单增李斯特菌。销售环境也关系到散装熟肉制品单增李斯特菌的污染程度,对于未包装的产品,专卖店优于农产品市场。     

三文鱼鱼籽中单增李斯特菌的生长抑制模型

运用响应面法,考察了不同温度(4℃~45℃)条件下,Nisin(0~500 mg/kg)和山梨酸钾(0~3 000 mg/kg)对三文鱼鱼籽中单增李斯特菌生长的影响,并模拟其迟滞期和生长速率。所建立的迟滞期和生长速率方程相关系数分别为0.99和0.98。温度、Nisin、山梨酸钾对单增李斯特菌的迟滞期和生长速率均产生显著影响(p0.05),温度与Nisin和山梨酸钾的交互作用均显著(p0.05),而Nisin与山梨酸钾交互作用不显著(p0.05)。温度不高于25℃时,增加Nisin或山梨酸钾的浓度可延长单增李斯特菌的迟滞期;高浓度的Nisin或山梨酸钾降低其生长速率主要在温度(25℃~37℃)非常适合单增李斯特菌生长的条件下发生。