实时荧光PCR方法快速检测鉴定啤酒有害菌的研究

本文对PCR方法快速检测鉴定啤酒有害菌进行了研究,结果表明使用实时荧光PCR方法检测啤酒有害菌可以将检测时间缩短至48h,并可以同时得到检测与鉴定的结果。该方法有较好的特异性、可重复性,相比传统培养基法,PCR法的检测结果准确可靠。     

空肠弯曲菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

以C.jejuni ORF-C基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测C.jejuni的方法。结果显示,对15株试验菌株进行荧光定量PCR检测,只有C.jejuni菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为11 CFU/m L,利用该检测方法对采集的60份样品进行检测,共计检出1份C.jejuni阳性样品,与国标法GB 4789.9—2014检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

实时荧光定量PCR技术快速检测志贺氏菌

目的 建立实时荧光定量PCR法快速检测志贺氏菌。方法 提取志贺氏菌基因组为模板扩增virA基因片段, 将目的片段连接至pMD19-T载体得到重组质粒, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 验证所得到的重组质粒, 以紫外分光光度计测量重组质粒吸光度值A260, 并换算为质粒拷贝数后作梯度稀释得到不同浓度的质粒标准品; 进行荧光定量PCR分析并通过特异性、灵敏性实验以验证该方法的可行性。结果 重组质粒标准品浓度在103~108 copies/μL范围内线性关系良好(r2>0.99), 实时荧光定量PCR检测志贺氏菌时出现良好的扩增曲线, 鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均未出现扩增曲线。志贺氏菌的检出限为100 CFU/mL。 结论 本方法便捷、高效、可靠, 可用于志贺氏菌的快速定性定量检测。     

食品沙门氏菌实时荧光PCR快速检测方法建立

根据Genbank提供的沙门氏菌ttrBCA基因序列设计引物和探针,建立了食品沙门氏菌实时荧光PCR快速检测方法。结果显示,该方法只对沙门氏菌基因呈阳性反应,而对其它常见非阳性菌株(志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、单增李斯特氏菌、阴沟肠杆菌、副溶血性弧菌)基因组DNA均呈阴性反应,对模拟添加沙门氏菌样品检测,检测低限为240cfu/mL沙门氏菌的DNA,检测食品样品增菌液,仅需约3h,结果表明,该方法适用于食品样品的快速检测。     

银白色葡萄球菌实时荧光PCR快速检测方法的建立

本文旨在建立一种银白色葡萄球菌实时荧光PCR检测方法。根据对NCBI数据库中银白色葡萄球菌非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因序列的比对分析,设计引物及探针,并基于所设计的引物及探针建立Taq-man 实时荧光PCR的检测方法。结果表明,本实验所建立的方法特异性较强,只能扩增出银白色葡萄球菌,而其他常见菌株的检测结果呈阴性;该方法的灵敏度为 10 pg/uL;在对实验室通过传统方法分离的金黄色葡萄球菌的检测中,发现有两个分离菌株呈阳性,其结果与普通PCR方法完全一致。     

金黄色葡萄球菌实时荧光PCR快速检测方法的建立

为建立检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)的快速检测方法,以SA Sa442基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光PCR快速检测SA的方法。结果显示,对16株试验菌株进行荧光PCR检测,只有SA检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为7.5 CFU/m L,利用该检测方法对采集的175份样品进行检测,共计检出5份SA阳性样品,与国标法(GB 4789.10—2010)检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

基于内参的志贺氏菌实时荧光定量PCR快速检测

根据Genbank已公布的志贺氏菌基因组序列,筛选特异性靶基因ipa H,设计特异性引物和探针,优化反应体系,并在体系中加入内参(IAC),通过标记不同荧光基团的Taq Man探针来监测IAC,进而实时监控整个PCR反应过程。按照人工污染样品,以评价所建立反应体系的性能。以志贺氏菌基因组DNA为模板,最低检测限为1 pg/u L;以10倍梯度稀释的菌液用水煮法提取DNA为模板,最低检测限为9×103CFU/m L;以含有ipa H的质粒为模板,最低检测限可以达到103考贝/u L;建立ipa H和ipa H-IAC标准曲线,Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(R2=0.999);人工污染初始菌量为20 g中10 CFU的羊肉时,志贺氏菌在增菌6 h后即可检出(水洗加试剂盒法)。作者建立的ipa H-IAC实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中志贺氏菌,又能实时监测PCR反应过程,有效防止"假阴性"的发生,进一步保证了结果的可靠性,有利于实现样品中志贺氏菌实时荧光定量PCR检测方法的标准化。     

驼乳中布鲁氏菌实时荧光PCR快速检测方法的建立

目的 建立驼乳中布鲁氏菌的实时荧光PCR快速检测方法.方法 根据布鲁氏菌外膜蛋白omp10基因的碱基序列,设计引物探针,从模拟布鲁氏菌污染的驼乳中提取布鲁氏菌DNA片段进行实时荧光PCR扩增检测.结果 该方法从布鲁氏菌M5株中扩增出了特异性目的片段omp10,而对大肠埃希式杆菌等细菌的扩增结果均为阴性.经过10倍倍比稀...     

溶藻弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立溶藻弧菌(VA)的快速检测方法,本研究以VA Collagenase基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测VA的方法。结果显示,对15株实验菌株进行荧光定量PCR检测,只有VA菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为18 cfu/m L;稳定性和重复性实验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的165份样品进行检测,共计检出2份VA阳性样品,与SN/T2564-2010行标法检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

溶藻弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立溶藻弧菌（VA）的快速检测方法,本研究以VA Collagenase基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测VA的方法。结果显示,对15株实验菌株进行荧光定量PCR检测,只有VA菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为18 cfu/m L;稳定性和重复性实验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的165份样品进行检测,共计检出2份VA阳性样品,与SN/T2564-2010行标法检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。      

实时荧光定量PCR法快速检测食品中大肠埃希菌

目的应用实时荧光定量PCR技术,结合3~5 h的前增菌处理,建立食品中大肠埃希菌的快速、灵敏、定量的检测方法。方法以大肠埃希菌(ATCC 25922)为参考菌株,对培养基和培养温度进行优化,选择最佳的前增菌培养条件。将不同浓度的参考菌株和样品分别接种前增菌液中培养3~5 h。采用Triton-X 100提取增菌后的DNA,实时荧光定量PCR扩增大肠埃希菌特异性片段。所得Ct与对应的原始(增菌前)参考菌株的浓度,建立标准曲线,计算样品中大肠埃希菌的数量。结果纯培养模式下,经过3、4和5 h的前增菌后,标准曲线具有很好的线性,r2分别为0.996、0.992和0.991,对应的检测限为136、14和1.4 cfu/100 ml;含杂菌培养模式下,NB和EC肉汤42.0℃增菌4 h后,建立的标准曲线r2分别为0.972和0.978。在不同食品中该方法的加标回收率为74.0%~174.0%。结论 3~5 h的前增菌实时荧光定量PCR方法可以快速、灵敏、定量地检测食品中活的大肠埃希菌。     

包装饮用水中铜绿假单胞菌实时荧光定量PCR快速检测

目的:有效弥补传统微生物学检验方法的缺陷。方法:针对GB 8538—2022中铜绿假单胞菌的毒力基因pcrL和16S rRNA基因的V3～V4区保守序列设计合成引物和探针,建立实时荧光PCR方法。结果:该方法可以有效扩增常见标准储备菌株的16S rRNA基因,且对铜绿假单胞菌标准储备菌株的毒力基因pcrL的检测效果良好,观察到明显的“S”型扩增曲线,但对常见的食源性致病菌无扩增曲线。当菌液浓度<10 CFU/mL时,pcrL基因仍有扩增曲线,其检测范围为10～10⁷ CFU/mL,检测限为10 CFU/mL;不同菌液浓度下毒力基因pcrL的Ct平均值为18.0～38.6。对近3年湖南省14个县、市抽查检验(瓶)桶装水中铜绿假单胞菌不合格样品进行进一步检测,符合率达到100%。结论:该方法对铜绿假单胞菌携带毒力因子pcrL检测的灵敏度较高;且操作简便、特异性强,具有良好的实用性。     

TaqMan探针法实时荧光定量PCR快速检测沙门菌的探讨

为建立一种快速、灵敏、特异的实时荧光定量PCR法用于沙门菌的检验，根据GenBank上登录的编号为AE016841的沙门菌序列，应用生物学软件在fimY基因的保守区设计引物和TaqMan探针，同时应用BLAST程序进行网上序列比对，并进行筛选、优化。用鼠伤寒标准菌和60份食品样本进行本检测方法的特异性、敏感性和重复性试验，并与常规法和科玛嘉平板分离法做比较。本方法对沙门菌的检测具高度的特异性，检测的灵敏度这102CFU／ml，从增菌至完成检测仅需24h左右，是一种快速检测沙门菌的敏感、特异的新方法。     

2种弧菌的实时荧光PCR快速检测

目的为快速、特异、灵敏的检测致病性弧菌,建立致病性弧菌的实时荧光PCR方法。方法针对霍乱弧菌的种特异性基因ompW、毒力基因tcpA、ctxA和副溶血性弧菌的种特异性基因tl、毒力基因tdh设计引物和Taqman荧光探针,建立实时荧光PCR检测方法。结果该方法能够特异性地检出副溶血性弧菌或霍乱弧菌,并进一步确定其是否携带tdh、tcpA或ctxA毒力基因,检测的灵敏度可达到10CFU/ml或0.1716μg/ml(pg/μl)DNA模板浓度。结论该方法特异性强、灵敏度高,适用于食品中致病性弧菌的快速检验。     

实时PCR检测食品中荧光假单胞菌方法的建立

针对荧光假单胞菌分子检测靶点gyrB基因设计引物和探针,制备标准质粒,绘制标准曲线,建立荧光假单胞菌实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测体系。特异性评价表明该体系能够特异性检测荧光假单胞菌,其他细菌均无检出。灵敏性检测结果表明纯DNA水平灵敏度可达14.3 fg/μL,纯培养物水平上检测灵敏度为3.0×102 CFU/mL。抗干扰性实验结果表明当加入低浓度背景干扰菌时,对上述体系检测灵敏度没有影响。人工污染样品检测表明适当增菌可检测到荧光假单胞菌,说明Taq Man探针real-time PCR法特异性强、灵敏度高、抗干扰性能力强。     

冬虫夏草实时荧光PCR检测方法的建立

建立冬虫夏草高效、灵敏的分子检测方法。以冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Saccardo核糖体(rDNA)内转录间隔区(ITS)为分子标记片段,通过对不同虫草同源序列的比对分析,设计对冬虫夏草具有特异性反应的实时荧光PCR引物和探针。该引物检测的目标DNA长度为80bp,对冬虫夏草DNA模版的检测含量可低至0.0001ng/μL。     

实时荧光PCR快速检测果汁中酿酒酵母的初步研究

研究建立了果汁中酿酒酵母的实时荧光PCR快速检测方法,并用于实际样品的检测,用活菌计数方法进行了验证.实时荧光PCR方法检测果汁中的酿酒酵母,全过程仅需约5h,检出限为单个的酿酒酵母细胞.本研究建立的实时荧光PCR检测方法大大缩短了果汁中酿酒酵母检测所需的时间,为果汁生产过程及产品中酿酒酵母的快速、灵敏检测提供了有效的技术手段 同时,本研究建立的实时荧光PCR方法可用于酿酒酵母的鉴定,与常用的生化鉴定方法相比,简化了鉴定步骤,提高了鉴定准确性,缩短了鉴定时间.     

实时荧光PCR快速检测果汁中酿酒酵母的初步研究

研究建立了果汁中酿酒酵母的实时荧光PCR快速检测方法,并用于实际样品的检测,用活菌计数方法进行了验证。实时荧光PCR方法检测果汁中的酿酒酵母,全过程仅需约5h,检出限为单个的酿酒酵母细胞。本研究建立的实时荧光PCR检测方法大大缩短了果汁中酿酒酵母检测所需的时间,为果汁生产过程及产品中酿酒酵母的快速、灵敏检测提供了有效的技术手段。同时,本研究建立的实时荧光PCR方法可用于酿酒酵母的鉴定,与常用的生化鉴定方法相比,简化了鉴定步骤,提高了鉴定准确性,缩短了鉴定时间。      

SYBR GreenⅠ实时PCR快速检测沙门菌

为应用SYBR GreenⅠ实时PCR技术建立沙门菌的快速检测方法，根据沙门菌invA基因序列的特点设计特异性引物，进行SYBR GreenⅠ实时PCR检测。以沙门菌及非同源性参考菌株做特异性检测；沙门菌不同群菌株做重现性检测；将沙门菌菌株稀释成不同梯度，做灵敏度检测。该方法有较好的特异性、重现性，沙门菌属5个群菌株均为阳性：而其它非同源菌株均为阴性。该方法灵敏度较高，检测低限为19CFU／ml。该方法特异性强，重现性好，敏感性高，可以快速、准确检测食品中沙门菌。应用实时PCR技术，利用SYBR GreenⅠ染料能选择性结合双链DNA的特点，可检测到沙门菌中invA基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号，且通过熔解曲线可知其熔点值约为80，4℃，而对其它非沙门菌则检测不到荧光信号。SYBR GreenⅠ实时PCR能通过熔解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，是基因鉴定检测的新方法。     

志贺氏菌实时荧光PCR检测试剂的研制

根据志贺氏菌ipaH基因序列设计了特异引物和探针,并对Taq 酶、Mg2 和引物探度等反应条件进行了优化.结果表明用实时荧光PCR法检测志贺氏茵具有特异性强、灵敏度高等突出的优点,可应用于进出口检验检疫、食品安全检测、疾病控制等领域.