维生素对大肠杆菌Escherichia coli.JN8产L-色氨酸的影响

研究了9种维生素对大肠杆菌Escherichia coli.JN8生长及其发酵产L-色氨酸产量的影响,并对发酵培养基中的维生素浓度进行了优化。结果表明,低浓度肌醇和叶酸可显著促进大肠杆菌的生长及L-色氨酸的合成,叶酸和肌醇的最适添加量分别为0.000 2 mg/L和0.2 mg/L;较高浓度的生物素可以明显促进菌体生长及色氨酸的合成,其最适添加量为0.12 mg/L;较低浓度VB6的添加严重抑制色氨酸的合成,当其质量浓度增至0.8 mg/L时,菌体浓度和色氨酸的产量均较对照有显著的提高,分别提高11.8%和27.2%。添加VB5可略微提高色氨酸的产量,最优质量浓度为0.4 mg/L。添加VB1、VB2、VB3和VC虽然对菌体的生长均有较强的促进作用,但对于色氨酸合成却有不同程度的抑制作用。     

有机氮源对L-色氨酸发酵的影响

以L-色氨酸生产菌Escherichia coli TRP03为供试菌株,研究了多种有机氮源对L-色氨酸发酵的影响。 首先对不同来源的酵母 粉进行了优化试验,确定一种最优酵母粉,摇瓶发酵时L-色氨酸可积累10.21g/L;利用5 L发酵罐发酵1.5～3.0h时,细胞出现二次生 长现象,选择添加氨基酸粉和氯化胆碱促进细胞生长,经优化实验,确定同时添加氨基酸粉2g/L、氯化胆碱0.5g/L可在很大程度上解 决细胞的二次生长问题并提高L-色氨酸产量至44.21g/L;为提高中后期菌体活力及产酸能力,选择在不同发酵时期流加质量浓度为 1g/L的酵母粉、蛋氨酸及谷氨酰胺混合液,确定10h流加时,中后期的活细胞数提高了30.18%,保证了菌体活力。菌株E. coli TRP03经36h发酵,可积累L-色氨酸51.23g/L,较未经任何优化的菌株提高41.91%。     

稀糖分罐发酵对L-色氨酸发酵的影响

为了解决现有L-色氨酸发酵工艺中浓糖补料和中途排料造成的乙酸积累过多和资源浪费等问题,该研究提出一种稀糖分罐 发酵的新工艺。 利用30 L发酵罐考察稀糖分罐发酵对L-色氨酸发酵的影响,在发酵中期（发酵时间为20 h左右）将部分发酵液移至另 一灭好菌的空罐继续进行发酵,并将浓糖替换为稀糖补料。 在稀糖分罐发酵工艺条件下,菌体生物量、L-色氨酸产量、糖酸转化率分 别为44.31 g/L、43.82 g/L、20%,较普通工艺分别提高了5.4%、9.9%和12.36%;乙酸积累量较普通工艺下降65.5%。 避免了料液的浪费, 提高了L-色氨酸产量和糖酸转化率,降低了乙酸积累量,在工业生产方面有一定实用性和推广价值。     

大肠杆菌高密度培养发酵L-色氨酸

为实现高水平的大肠杆菌高密度培养,提升发酵法产L-色氨酸的生产效率,以大肠杆菌TRTH为供试菌株,在初始发酵工艺的基础上,先后对发酵接种量和底物KH_2PO_4添加量各设置4个梯度进行发酵对比试验,并着重考察了底物KH_2PO_4添加量对菌体生长、产酸、磷酸盐消耗、糖酸转化率及副产物积累的影响。试验结果表明,在接种量为20%(体积分数),底物KH_2PO_4添加量为10 g/L时,最高菌体密度达到65. 39 g/L,最终L-色氨酸产量为59. 55 g/L,分别较优化前提高了45. 99%和31. 17%,发酵延滞期明显缩短,菌体生长迅速,原料利用率大幅提高,主要副产物积累量较低,发酵总体水平达到最优。为大肠杆菌高密度培养在L-色氨酸发酵中的应用提供了一个成本低、可行性高的新策略,同时为L-色氨酸发酵生产中底物磷酸盐的调控提供了参考。     

氮源对L-色氨酸发酵的影响

以L-色氨酸生产菌E.coli TRTH为供试菌株,研究了氮源对L-色氨酸发酵的影响。利用30 L发酵罐进行分批补料发酵试验,确定了最佳有机氮源和无机氮源分别为酵母粉和硫酸铵,进一步确定酵母粉和硫酸铵的最佳用量为1 g/L和10 g/L,最后采用NaOH和氨水混合补料控制发酵液中NH4+浓度在120 mmol/L以下,发酵38 h,菌体生物量和L-色氨酸产量分别达到53.42 g/L和32.6 g/L,实现了大肠杆菌的高密度培养。     

谷氨酸合成途径基因缺失对大肠杆菌发酵L-色氨酸的影响

降低谷氨酸的积累可提高L-色氨酸产量及糖酸转化率。敲除Escherichia coli TRTH中的谷氨酸脱氢酶及谷氨酸合成酶编码基因gdh A、glt B,构建TRTHA(TRTH,Δgdh A)、TRTHB(TRTH,Δglt B),考察gdh A、glt B缺失对L-色氨酸发酵的影响。结果表明,gdh A及glt B缺失能有效降低谷氨酸的积累,但会降低细胞生长及色氨酸合成;培养基中谷氨酸的添加可恢复TRTHA及TRTHB的生长及色氨酸合成能力。在含1 g/L谷氨酸培养基中,利用TRTHB发酵L-色氨酸,L-色氨酸产量(41.23 g/L)及糖酸转化率(15.45%)最高,较TRTH分别提高了10.92%和7.89%;谷氨酸生成量(5.72 g/L)及乙酸积累量(1.73 g/L)分别较TRTH降低了25.23%及提高了10.19%。TRTH和TRTHB代谢流分析结果表明,glt B缺失会降低谷氨酸合成代谢流并提高乙酸合成代谢流;TRTHB的色氨酸合成代谢流(11.4%)较TRTH提高了40.74%。     

大肠杆菌发酵生产L-色氨酸过程中的质粒稳定性

研究L-色氨酸生产菌Escherichia coli TR TH07-09的质粒稳定性,在培养过程中考察了选择压力、温度、溶氧及酵母抽提物等因素对质粒稳定性的影响。结果表明该菌具有较好的结构稳定性和分裂不稳定性,在无选择压力和操作条件控制不当的情况下,质粒有一定程度的丢失。     

色氨酸转运系统改造对大肠杆菌产L-色氨酸的影响

近年来,转运系统改造已经成为氨基酸菌株菌种改良的重要手段。本研究以工业生产菌Escherichia coli MT-01/p Trp-01为出发菌株,首先利用Red重组技术,在菌株MT-01/p Trp-01基因组上敲除了色氨酸吸收基因mtr,发酵结果表明,敲除敲除突变菌的L-色氨酸产量达到35.87 g/L,与出发菌株E.coli MT-01/p Trp-01相比提高了32%;在此基础上,进一步考察了三种不同启动子（Pr,Ptac,Pser A）控制下L-色氨酸分泌基因ydd G的差异表达对菌体生长及菌株产L-色氨酸的影响。结果表明,当采用组成型启动子tac时,ydd G基因的过表达菌株L-色氨酸的产量为41.01 g/L,比mtr敲除菌株E.coli MT-11/p Trp-01的产量提高了14.3%,当采用温度诱导型启动子Pr调控ydd G基因表达时,L-色氨酸的产量与mtr敲除菌株E.coli MT-11/p Trp-01的产量相比提高了9.3%,L-色氨酸的产量达到了39.22 g/L;而采用基因ser A的天然启动子调控ydd G表达时,菌体的生长受到了明显抑制,L-色氨酸产量仅有27.1 g/L的色氨酸。综上,大肠杆菌基因mtr的敲除和基因ydd G的过表达均可以有效提高工程菌株生产色氨酸的能力。      

大肠杆菌发酵产L-色氨酸培养基及补料优化

为了进一步提高优化大肠杆菌发酵产L-色氨酸的产量,采用响应面法优化了原初始发酵培养基组合成分,建立了乙酸铵-玉米浆补料模式。结果表明优化后培养基组合:0.12%硫酸铵、0.7%磷酸二氢钾、0.15%一水柠檬酸、0.28%七水硫酸镁、0.05%酵母粉、0810 0.39%乙酸铵、0.3%玉米浆。5 L罐的培养验证表明,玉米浆和乙酸铵是影响L-色氨酸产量的主要成分因素,优化后L-色氨酸产量提高了35.4%,发酵结束达到24.53 g/L,单位菌体L-色氨酸产量提高了19.8%,达到0.272 g/OD,糖酸转化率提高了27%,为L-色氨酸发酵提供一定的参考。     

L-色氨酸混菌发酵工艺

为解决L-色氨酸发酵过程中乙酸、乳酸等抑制性副产物积累对对菌体活力和色氨酸积累造成抑制的问题,利用2株色氨酸生产菌,即大肠杆菌TRTH和谷氨酸棒杆菌TQ2223进行混合发酵,利用谷氨酸棒杆菌代谢大肠杆菌产生的乙酸、乳酸等副产物,降低乙酸等副产物对大肠杆菌发酵的负面影响。通过单因素试验确定了混菌发酵的最佳接种间隔时间为14 h,谷氨酸棒杆菌TQ2223接种量为7. 5%,培养温度为36℃,p H 7. 0。在最佳工艺条件下进行了30 L发酵罐小试验证,结果显示,与普通发酵工艺相比,混菌发酵工艺的乙酸积累量减少84. 8%,乳酸积累量减少82. 9%,L-色氨酸产量提高13. 6%,糖酸转化率提高19. 1%。为发酵法高效生产L-色氨酸提供了新方案,为混菌发酵在氨基酸发酵中的应用提供了理论依据。     

琥珀酸对大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响

以色氨酸生产菌Escherichia coli TRT H为出发菌株,在30 L发酵罐上进行实验,在发酵10 h后随糖外源流加1g/L的琥珀酸,以降低代谢抑制物质的积累量,提高L-色氨酸的产量.实验结果显示:外源流加1g/L的琥珀酸发酵与未流加琥珀酸发酵相比,菌体生物量与L-色氨酸产量分别提高了5.4%和10.0%,乙酸积累量下降了9.5%,糖酸转化率提高了4.0%.这表明外源流加1 g/L琥珀酸发酵可以提高L-色氨酸的产量,降低乙酸的积累量,提高糖酸转化率.     

大肠杆菌生产L-组氨酸研究进展

L-组氨酸可用于生物医药领域治疗多种疾病,并且其生物合成路径广泛分布在细菌、古细菌、低等真核生物以及植物中。由于组氨酸的生物合成路径较长,调控机制复杂,一直是研究的热点。该文对大肠杆菌中L-组氨酸的生物合成路径进行了概述,同时综述了当前国内外生产L-组氨酸大肠杆菌的研究进展,最后结合当前的研究进展进行了展望。     

glmU基因单功能敲除对大肠杆菌生产氨基葡萄糖的影响

大肠杆菌中的glmU是葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶/葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶双功能基因。 同源单交换方法敲除大肠杆菌 中葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶单结构域基因glmU, 即利用重叠PCR将葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶结构域内603 bp序列与抗性基因 ampR连接,经过末端单酶切（HindⅢ）后电转化至大肠杆菌（E. coli）BL21感受态细胞中,经同源臂单交换,将抗性基因ampR整合至 glmU基因内部,实现该结构域功能失活的同时,保留葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶功能域活性。 通过发酵实验分析glmU单结构域缺 失在大肠杆菌中对氨基葡萄糖生产的影响。 结果表明,发酵20 h后重组菌的氨基葡萄糖产量为1 049.6 mg/L,为原始菌E. coli BL21氨 基葡萄糖产量103.34 mg/L的10.2倍。 表明glmU是影响大肠杆菌产生氨基葡萄糖的关键基因,敲除glmU基因可增加氨基葡萄糖积累。     

过量表达葡萄糖脱氢酶对E.coli羟基脂肪酸合成能力的影响

在工程大肠杆菌生产羟基脂肪酸的基础上,为解决构建的以葡萄糖为底物合成羟基脂肪酸(HFAs)代谢途径中存在的细胞内还原力(NADPH)不平衡的问题,克隆了来源于巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶(GDH)基因,构建了胞内HFAs和NADPH联产的工程菌株;实验结果表明该重组大肠杆菌合成HFAs的产量得到显著提高,摇瓶条件下HFAs产量达到173.9 mg/L。具有较好的工业化开发前景。      

过量表达苹果酸酶对E.coli脂肪酸合成能力的影响

为了考察苹果酸酶对原核生物脂肪酸合成能力的影响,本研究从E.coliK-12中克隆了苹果酸酶基因（NADPME,EC1.1.1.40）MaeB,并插入质粒pET30a-T,构建了重组质粒pMX20,经IPTG诱导在E.coli BL2（IDE3）获得了大量表达。摇瓶发酵结果表明,过量表达苹果酸酶基因会改变大肠杆菌脂肪酸合成能力,并在添加适宜底物苹果酸（15mmol/L）时,胞内总酯含量比受体菌提高了4倍,约197.74mg/g,产率为1.89%。本研究为脂肪酸生产提供了优良菌株,具有一定的应用开发前景。      

丝氨酸吸收系统多基因敲除对大肠杆菌产L-丝氨酸的影响

sst T、cyc A、sda C和tdc C是大肠杆菌L-丝氨酸的四个吸收基因,本文在前期吸收基因单基因敲除菌的基础上,系统研究了四个吸收基因不同组合敲除对菌株生长及L-丝氨酸生产的影响。摇瓶发酵结果表明,在11个多基因敲除突变菌中,sst T·sda C双基因敲除菌,sst T·sda C·tdc C和sst T·cyc A·sda C三基因敲除菌的L-丝氨酸产量与对照相比有明显提升,分别达到271.11、312.58和322.57 mg/L;sst T·cyc A·sda C·tdc C四基因敲除菌的L-丝氨酸产量最高,达到了450.58 mg/L,是对照菌的6倍。在菌株生长方面,双基因敲除菌和三基因敲除菌的生长量优于对照菌或者与对照菌相近,而四基因敲除菌的生长量与对照菌相比则下降了28%。      

Effect of post-induction substrate oscillation on recombinant alkaline phosphatase production expressed in Escherichia coli

Microorganisms are exposed to fast changes in microenvironment in large scale bioreactors. Because of their fast response to the changes, overall performance of biological system in small scale differs from large scale. Hence the variations in the environment that microorganisms are living in are mimicked in small scale. For this purpose one way is to feed substrate into the bioreactor in an oscillatory profile. In this work two different types of triangular oscillatory feeding profiles were applied as the post induction feeding strategy in intracellular recombinant alkaline phosphatase production expressed in Escherichia coli to find out if this biological system behaves in inhomogeneous environment differently. On line and offline measurements provide evaluation of product quality and quantity. Then the results of the experiments were compared with those of the control run at which constant feeding rate was executed. The results showed that oscillatory feeding at which cells were not starved led to higher yield of protein per substrate (0.027 C-mol/C-mol) and higher activity per protein (0.79 U/mg) when compared to a constant feeding rate (0.011 C-mol/C-mol and 0.11 U/mg).