新型重组别藻蓝蛋白的高密度发酵生产和升白作用

在工程菌株JM109中实现了带有6×His标记的新型重组别藻蓝蛋白HAPC的高效表达。工程菌的发酵采用两步法,37℃扩增生长6h,30℃诱导培养10h。发酵液最终菌体密度(OD600)达26.25,表达蛋白占菌体总蛋白的31%。进一步用金属螯合亲和层析纯化使其纯度达90%以上。用纯化的HAPC对S180荷瘤小鼠灌胃,每天1.5~4.5mg/kg,共10天。结果表明HAPC具有明显的升白作用,可对抗环磷酰胺对免疫系统的破坏作用。     

镭普克的制备及对小鼠H22肝癌的抑制作用

报道重组别藻蓝蛋白(rAPC,镭普克)表达菌株的20L高密度发酵、镭普克制备及对小鼠H22肝癌抑制作用的实验结果。采用两步发酵法最终OD600为36．18,比一步发酵法的40．16值低,但镭普克表达率是后者的1．8倍,为30．24％,镭普克生物量提高1．62倍。亲合层析结合分子筛层析纯化后,镭普克纯度可达98．03％。对小鼠H22肝癌静脉注射剂量为50mg/kg／d,抑瘤率为62．2％。初步的免疫实验结果表明,镭普克对淋巴B细胞功能具有增强作用。结果提示镭普克大规模生产的潜力和临床应用的可能性。     

中国明对虾线粒体MnSOD在大肠杆菌中的重组表达、产物纯化及活性测定

采用PCR方法扩增编码中国明对虾线粒体锰超氧化物歧化酶(MnSOD)成熟肽的基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pCRR T7/NT TOPOR TA中进行体外重组表达.重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS后,经IPTG诱导表达产生包涵体形式的目的蛋白.对重组蛋白进行 LC-ESI-MS 分析的结果表明,融合蛋白的三个肽段与中国明对虾线粒体MnSOD 相应肽段完全一致.将重组蛋白通过金属螯合柱进行纯化,进而透析、复性,最后获得了活性高达2373U/mg的重组蛋白.中国明对虾线粒体MnSOD的成功表达,为深入研究其在中国明对虾免疫反应和抗氧化胁迫中的作用奠定了基础.     

位点特异性重组酶Cre的克隆、表达、纯化及体外活性鉴定

克隆了Cre基因，分别构建了真核表达载体pEF-EBFP-Cre和pGEX-Cre，在大肠杆菌中表达了Cre重组酶，并证明了重组酶的删除特性，为进一步在转基因动物乳腺生物反应器中使用此酶打下基础。     

人体c-Mpl分子配体蛋白XP1的表达、纯化及活性初步鉴定

TPO是近年发现的血小板生成素，它通过与其受体c-Mpl的结合刺激巨核细胞的发生，调节动物或人体血小板的生成。利用酵母双杂交系统，以人体c-Mpl受体作为诱饵蛋白，我们从人体肝脏cDNA文库筛选到另一与c-Mpl相结合的新配体，命名为XP1。将：xpl-cDNA构建到pET-28b大肠杆菌融合表达载体，经金属离子亲和层析柱和DEAE阴离子层析柱分离纯化，获得纯度为99％的His-XPI水溶性融合蛋白。表达产物利用小鼠巨核细胞集落形成单位测定活性。结果表明：xpl基因在大肠杆菌中获得高效水溶性表达；其产物对小鼠骨髓细胞巨核细胞集落形成单位有明显的刺激作用。     

人免疫缺陷病毒I型p24gag基因的重组与表达

将编码人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４，并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达，产物为３０ｋＤａ的ｓ１９－ｐ２４融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组ｐ２４蛋白均与抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ－１阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原性。     

HIV-1核心蛋白的表达与纯化

将编码人I型免疫缺陷病毒(HIV1)核心蛋白p24gag的基因序列克隆到原核表达载体pET28(b)中,高效表达了N,C端融合His·Tagp24蛋白,所表达的重组p24蛋白占菌体总蛋白的46%。在变性条件下,使用NiNTA亲和层析法纯化了p24蛋白,纯度为94%。菌体中及纯化、复性后的目的蛋白均能与抗HIV1p24单克隆抗体发生特异性反应。用纯化的p24蛋白免疫小鼠,4周时小鼠血清抗p24抗体效价达1∶400。实验结果表明:大肠杆菌表达的HIV1p24蛋白纯化后可用作HIV1检测试剂的原料。     

超声作用下大肠杆菌细胞膜通透性的动力学模型

在合理假设的基础上运用传递理论以及普遍成立的质量守恒原理,建立了超声作用大肠杆菌膜变化的动力学模型：E（t）=（k3T-k1/）（k2＋k3）·e-（k2＋k3）·t＋（k2T-k1/k2＋k3）。基于该模型的理论模拟结果与实验结果比较表明：该动力学模型对膜变化过程具有很好的预测功能,能反映膜变化的实际过程。（E-胞内荧光素的浓度;t-时间;T-胞内外渗透物质总量;k1-细胞死亡后引起的荧光素损失速率常数;k2-荧光素从胞外渗透入胞内的速率常数;k3-荧光素从胞内渗出胞外后又反渗透入胞内的速率常数。）