酶解法制备绵羊乳酪蛋白ACE抑制肽的工艺优化及其抑制机制

为优化酶解法制备绵羊乳酪蛋白ACE抑制肽的工艺条件以及筛选和鉴定一种新的ACE抑制肽,选用5种蛋白酶水解酪蛋白,以水解度、分子质量分布和ACE抑制率为指标筛选最适蛋白酶,采用单因素和响应面试验优化工艺,采用三合一质谱仪(Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS)方法鉴定分子质量小于3 ku组分的氨基酸序列,筛选潜在ACE抑制肽,进行人工合成,测定其IC50值。采用Linewaver-Burk作图确定酶抑制动力学,结合分子对接解析肽段的抑制机制。结果表明:碱性蛋白酶水解酪蛋白的最佳条件为pH 6、底物含量8%、酶添加量4%、温度55 ℃、水解时间90 min,此时酪蛋白水解液ACE抑制率为99.1%。验证具有ACE抑制活性的肽段10条,筛选出一条新颖的降血压肽——LFRQFY(源自αs1-酪蛋白),其ACE抑制活性的IC50为(7.9±1.7)μmol/L,酶抑制动力学为混合抑制模式。分子对接结果表明:LFRQFY能与ACE的氨基酸残基Ala354(活性口袋S1)、His353(活性口袋S2)形成氢键,具有显著的体外降血压活性。     

山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽的分离、纯化及鉴定

针对木本油料山杏的蛋白质高值化利用问题,利用蛋白酶Alcalase酶解山杏仁蛋白,以体外α-葡萄糖苷酶抑制能力作为评价指标,筛选高活性α-葡萄糖苷酶抑制肽。山杏仁蛋白酶解液通过超滤、G-25葡聚糖凝胶柱、分子筛以及反相高效液相色谱的分离纯化,最终筛选得到2种高活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽,其抑制能力分别为6.6μg/mL和7.0μg/mL。利用质谱和氨基酸测序仪对两种α-葡萄糖苷酶抑制肽的分子质量以及序列结构进行了研究,确认2种山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽分别为色氨酸-丙氨酸(WA)和苏氨酸-色氨酸(TW),其α-葡萄糖苷酶抑制能力的IC_(50)值分别为23.97μmol/L和22.93μmol/L。     

奶酪发酵剂红曲霉的筛选及其对奶酪理化、质构和抗氧化性的影响

为筛选适宜用作奶酪发酵剂的红曲霉菌株，通过对传统红曲发酵食品进行增菌培养，采用平板划线法初筛。将初筛菌株以一种新型短期成熟工艺制备奶酪进行风味品评复筛，最终筛选出6株疑似红曲霉的风味优势菌，通过DNA序列比对，确认为红曲霉。将6株优势菌以短熟工艺制备奶酪样品，并进行安全性、功能性、理化指标、质构和抗氧化性的检测，分析其对奶酪品质的影响。结果表明，红曲霉菌株BC20及ZX-99同时具备食用安全性及奶酪熟化能力。在奶酪成熟结束时，奶酪样品中的桔霉素含量皆低于国标检测限25μg/kg,远低于定量限80μg/kg, pH 4.6可溶性氮含量分别为(40.99±0.90)%、(26.05±0.56)%。该研究筛选出2株适宜制作成熟奶酪的红曲霉菌株，提供了一种制备红曲霉奶酪的新型短熟工艺，为红曲霉奶酪品质的优化及缩短成熟期、减少生产成本提供依据。     

源于鸡蛋清溶菌酶ACE抑制肽的分离纯化及结构鉴定

利用胃肠消化酶系水解疏水性氨基酸含量高的蛋清溶菌酶蛋白,筛选能抗胃肠消化的高活性ACE抑制肽。通过超滤、制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)、分析型RP-HPLC纯化、氨基酸组成分析及基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF-MS),从胃肠消化水解液中分离鉴定出两种ACE抑制肽Lys-Val-Phe(KVF)和Trp-Ile-Arg(WIR),化学合成该两种三肽后,ACE抑制活性测定结果显示其IC50值分别为14μmol/L与88.5μmol/L。研究结果表明,蛋清溶菌酶蛋白来源的ACE抑制肽有望用于高血压的预防与治疗。     

多肽类ACE抑制剂的设计合成及生物活性

本研究以血管紧张素I转化酶(angiotensin converting enzyme, ACE)抑制肽PHP1和PHP2为研究母肽,通过替换氨基酸残基改变目标多肽的疏水性、带电性等因素,利用生物信息学工具评估多肽潜在的生物活性,设计了19个多肽类似物。采用多肽固相合成法合成目的多肽类似物,并进行体外生物活性检测。结果显示多肽类似物均具有较高的ACE抑制活性,其中,PHP1A-6(IC₅₀=3.87μmol/L)、PHP2A-3(IC₅₀=3.33μmol/L)、PHP2A-4(IC₅₀=2.86μmol/L)和PHP2A-7(IC₅₀=4.58μmol/L)的ACE抑制活性最高,较母肽有显著提高(P<0.05),PHP1A-3、PHP1A-4、PHP1A-7、PHP2A-1和PHP2A-10具有同母肽相当的抑制活性,IC₅₀<10μmol/L。绝大部分多肽类似物的α-葡萄糖苷酶抑制活性与母肽相比均有明显提高,PHP1A-3(IC₅₀=3.09...     

两种来源于牛皮胶原蛋白的新型ACE抑制肽

从牛皮胶原蛋白中鉴定分离出抑制血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)的多肽片段。首先优化牛皮胶原蛋白水解方法,应用胃蛋白酶和碱性蛋白酶获得活性最高的水解产物(抑制ACE的IC50为0.168 mg/m L)。经MW 5000超滤分离后,得到水解液中活性最高的部分(IC50为0.079 mg/m L)。对分离后低于MW 5000的部分经RP-HPLC进一步分离,发现含有大量ACE抑制肽,并应用RP-HPLC-MS/MS鉴定出两种新型ACE抑制肽,氨基酸序列分别为ISVPGPM和LGPVGNPGPA,IC50值分别为0.017 mg/m L(24.3μmol/L)和0.077 mg/m L(87.8μmol/L)。最后,本文模拟了两种抑制肽在体内生理环境下的消化,发现均可被部分降解,且消化产物具有与原始多肽相近的ACE抑制活性。     

发酵酸化技术对乳饼蛋白质降解及蛋白肽生物活性的影响

通过发酵酸化技术研制发酵型乳饼,以传统的直接酸化技术为对照,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）、液相色谱-质谱测定乳饼蛋白质降解情况和游离氨基酸含量,通过用液相色谱-串联质谱鉴定乳饼蛋白肽。并通过测定体外抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制率和血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）抑制率表征乳饼蛋白肽的生物活性。SDS-PAGE结果表明,两种酸化技术均能促进乳饼蛋白质的降解,发酵酸化技术对乳清蛋白的降解程度更高,能促进游离氨基酸的释放。从发酵酸化乳饼中鉴定出潜在的ACE抑制肽23?条、抗氧化肽6?条和降糖肽5?条,而传统的直接酸化乳饼中分别为13、4?条和1?条。发酵酸化技术能显著提升乳饼蛋白肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性和ACE抑制活性（P＜0.05）,其中分子质量＜3?kDa超滤组分对二者抑制率的IC50分别为1.250?mg/mL和0.416?mg/mL。发酵酸化技术能促进乳饼蛋白质降解,释放生物活性多肽,同时产生游离氨基酸,提升乳饼的生物学价值。     

大河乌猪火腿中新型α-葡萄糖苷酶抑制肽的分离、鉴定及活性研究

大河乌猪火腿在发酵和后熟过程中蛋白质降解可产生丰富的生物活性肽。为探究大河乌猪火腿中是否存在α-葡萄糖苷酶抑制肽及其活性,以大河乌猪火腿为研究对象,通过超滤分离方法制备了不同分子质量的火腿肽;以α-葡萄糖苷酶抑制率为指标,采用肽组学结合生物信息学分析方法对火腿肽进行鉴定、筛选和活性研究。结果表明：分子质量小于3 kDa的大河乌猪火腿肽具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。从大河乌猪火腿中共鉴定出143条主要来源于肌球蛋白、肌钙蛋白和β-烯醇化酶的肽序列,进一步筛选出的肽段IEEALGDK具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性(IC₅₀值为1.42 mg/mL)。BIOPEP-UWM数据库检索结果显示,肽段IEEALGDK为新型的生物活性肽。肽的稳定性研究表明,肽段IEEALGDK具有较好的热稳定性、耐酸碱性和胃肠道消化稳定性。分子对接结果显示,肽段IEEALGDK主要通过氢键和疏水相互作用占据α-葡萄糖苷酶的活性残基位点Arg594、Arg727、Arg799和Arg467发挥活性作用。大河乌猪火腿的肽段IEEALGDK为新型生物活性肽,具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,研...     

豆粕血管紧张素转化酶抑制肽的结构鉴定及作用机制解析

以大豆粕为原材料,利用超声辅助酶解技术、超滤-?KTA层析相结合的方法分离纯化获取豆粕酶解产物中血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）抑制肽,对其分子质量分布进行研究,后通过质谱分析与分子对接技术鉴定并筛选出ACE抑制活性肽的氨基酸序列,经固相合成肽序列,检测其ACE抑制肽的活性并基于分子对接技术探索其抑制机制。结果表明：经超声辅助酶解提取获得的豆粕肽分子质量主要分布在6 000 Da以下;根据分子对接的最低预测自由能筛选出的GVRP（－8.44 kcal/mol）和IIVTP（－9.04 kcal/mol）可以抑制ACE活性,半抑制浓度（50% inhibitory concentration,IC50）分别为（84±0.06）、（77±0.08）μmol/L;分子对接结果表明：GVRP、IIVTP能够与ACE的活性口袋S1、S1′、S2形成氢键相互作用,共有的过近接触（3.5 ?范围内）ACE氨基酸残基为His513、Ala354和Glu384。本研究基于串联质谱与分子对接技术,建立从混合多肽中快速鉴定、筛选活性多肽的方法,探究活性多肽与ACE稳定结合并体现其ACE活性的抑制机制,为后续的深入研究提供一定参考。     

红松仁清蛋白ACE抑制肽的分离纯化与结构鉴定

为研究酶解红松仁清蛋白中具有血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性短肽的组分及其序列,采用超滤、Sephadex G-25、Sephadex G-15及反相高效液相色谱对松仁清蛋白酶解液进行分离纯化,对纯化后样品(组分D2)进行质谱结构鉴定。质谱结果进行从头测序,筛选得到ACE抑制肽Tyr-Leu-Leu-Lys(YLLK),分子质量为535.34 D。该肽经固相合成纯度为99.80%,其半数抑制浓度测定值为0.282 5 μmol/L。     

α-乳白蛋白源ACE抑制肽快速筛选及验证

采用生物信息学手段，利用在线工具对α-乳白蛋白进行虚拟酶解，通过对活性肽的活性、毒性及理化性质进行预测，并结合分子对接的方法实现快速精准筛选新的血管紧张素转化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）抑制肽Pro-Glu-Trp（PEW）。通过固相合成法制备出活性肽PEW进行体外活性验证，其半抑制浓度（IC50）为3?130?μmol/L。全柔性分子对接模拟结果表明，PEW与ACE活性口袋S1相互作用可能是其具有ACE抑制活性的主要原因，氢键、疏水作用力、静电力是维持两者结合的主要作用力。与传统方法相比，本研究可以快速高效地筛选出ACE抑制肽，为食源性活性肽的快速筛选提供了新思路。     

荔枝果肉多糖级分的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

为了探究不同荔枝果肉多糖级分的理化性质、抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性差异,采用DEAE-52离子交换树脂分离纯化得到2种荔枝果肉多糖级分LPI和LPII,比较两者的中性糖、糖醛酸和蛋白质含量,并采用氧自由基清除能力(ORAC)和细胞抗氧化(CAA)评价其抗氧化活性,采用对-硝基酚-α-D吡喃葡萄糖苷(PNPG)法探究其α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究结果表明LPII含有较多的中性糖和蛋白质,较少的糖醛酸,表现出更强的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中LPI和LPII的ORAC和CAA值分别是24.51,30.08μmol/g和5.36,8.72μmol/g,其抑制α-葡萄糖苷的IC_(50)值分别是0.33,0.26 mg/m L。荔枝果肉多糖的生物活性与其中性糖和蛋白质含量密切相关。     

微生物发酵法制备大豆ACE抑制肽菌种的筛选

以大豆分离蛋白为底物,以血管紧张素转化酶(ACE)抑制率和肽含量为检测指标,选择5株乳酸菌、3株霉菌和1株枯草芽孢杆菌为出发菌种,通过微生物发酵筛选出具有高ACE抑制活性的发酵菌株。结果表明:乳酸菌中具有强ACE抑制活性的菌株为保加利亚乳杆菌,ACE抑制率和肽含量分别为57.93%和3.27mg/mL;霉菌中具有强ACE抑制活性的菌株为米曲霉,ACE抑制率和肽含量分别为41.23%和2.17mg/mL;枯草芽孢杆菌ACE抑制率和肽含量分别为45.02%和2.25mg/mL。综合比较9种菌株的发酵特性,选用保加利亚乳杆菌作为制备大豆抗高血压活性肽优良菌株。     

人参肽的分离纯化及活性分析

以粗人参肽为原料,80%乙醇为洗脱溶液,用DA201-C大孔树脂进行纯化,测定纯化前后多肽的抗氧化活性(DPPH·清除能力、羟自由基清除能力、还原力)、酪氨酸酶抑制能力、α-葡萄糖苷酶抑制能力等生物活性及分子量分布、氨基酸组成、滋味等指标。在活性方面,粗人参肽具有一定的抗氧化活性,酪氨酸酶抑制活性,α-葡萄糖苷酶抑制活性,纯化后抗氧化活性提高不明显,酪氨酸酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性均有较大提高,尤其是α-葡萄糖苷酶抑制活性提高较显著,在10mg/mL时是纯化前的13.29倍。在分子量方面,粗人参肽中1500Da以上的占比25.37%,纯化后分子量减小,1000Da以下占比85%以上;在氨基酸组成方面,纯化前后人参肽中甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸和谷氨酸含量均较高,分别为73.2%和75.4%;纯化后疏水性氨基酸显著增加,增幅为12.15%。在滋味方面,纯化后苦味较突出,苦味值为8.00。实验结果表明,人参肽的抗氧化活性可能与甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸和谷氨酸含量较高有关;酪氨酸酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性可能与丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸等疏水性氨基酸含量增加且纯化后分子量变小...     

HPLC-ESI-MS对珠蛋白酶解液中的血管紧张素Ⅰ转换酶抑制肽的分离鉴定

本实验利用ESI-MS/MS对反相高效液相色谱分离的具有血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)抑制活性的珠蛋白小肽的结构进行鉴定.结果表明此肽的序列为Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr(VVYPWT),位于猪的血红蛋白β链的34-39氨基酸序列片断,它对ACE有很好的抑制活性,其IC50为6.02μmol/L.     

基于LC-MS/MS的酸乳肽谱及ACE抑制活性

利用液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)的方法,对4种酸乳(优味舒风味发酵乳、风味发酵乳、初乳24+K风味发酵乳和十天风味发酵乳)的肽谱进行分析,分别鉴定到152、125、364条和274条肽段。利用血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)的抑制活性比较以上4种酸乳的生物活性,在相同质量浓度2.0 mg/L时,4种酸乳ACE抑制率分别为46.84%、42.75%、77.41%和63.84%。初乳24+K风味发酵乳含有肽的数量大、ACE抑制活性高可能与其独特的原料成分相关。对4种酸乳的肽谱及ACE抑制活性的考察,为进一步研究酸乳肽的功能特点和ACE抑制活性提供了理论依据。     

基于生物信息学与分子对接技术对坛紫菜降血压肽的筛选及活性分析

采用木瓜蛋白酶和糜蛋白酶双酶联合水解坛紫菜蛋白（Porphyra haitanensis protein,PHP）制备降血压活性肽,测定了经超滤后各个分子质量PHP酶解液清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基和2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS）阳离子自由基能力、铁离子还原抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power,FRAP）以及血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme,ACE）抑制活性。经质谱鉴定和活性肽数据库BIOPEP以及AHTPDB网站查找筛选活性肽,采用分子对接解释多肽抑制ACE机理,并对双酶酶解PHP动力学进行研究。结果表明：经超滤后的8?个分子质量的坛紫菜多肽组分中,＜0.5?kDa的组分具有最高DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力,＜1?kDa的组分具有最高FRAP值,而0.5～1?kDa组分IC50值（（2.21±0.28）mg/mL）最低。经查找筛选出14?条降血压肽,其中4?条肽的序列和对接能量分别为AVP（－5.87?kJ/mol）、GPL（－6.13?kJ/mol）、LDY（－7.65?kJ/mol）和LGYL（－7.78?kJ/mol）。酶解动力学模型预测PHP水解度与实验水解度相对误差在10%以下。本实验基于串联质谱与分子对接技术,通过生物信息筛选和体外活性检测从混合多肽中快速鉴定、筛选活性多肽,探究多肽抑制ACE的机理,并建立了描述蛋白可控酶解过程规律的动力学模型,为活性肽的制备提供了参考和借鉴。     

豆豉功能性的研究

本文对不同品种豆豉的抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制和血管紧张素转换酶(ACE)抑制效果进行了比较,并对埃及曲霉纯种发酵曲中ACE抑制剂与ACE和肠胃蛋白酶预混合保温后的抑制活性进行分析,结果表明豆豉曲提取液具有较好的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制效果;与ACE预混合保温后ACE抑制活性变化不大,而被不同的肠胃蛋白酶消化后抑制活性均有较大的提高,为前药型抑制剂。     

降糖肽Aglycin的高效表达及活性鉴定

基于自组装肽ELK16能在大肠杆菌细胞内自聚集的特性,本研究将Aglycin通过一个内含肽Mxe GyrA与自组装肽连接,构建能在体外自剪切的重组表达载体pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行蛋白表达条件的优化,得到目的蛋白聚集体,随后对聚集体进行DTT切割条件的优化,经过进一步纯化最终可得到纯度为98.15%、产量为5.53mg/g菌体湿重的Aglycin肽。采用基因工程手段重组表达Aglycin的产量比目前化学提取方法提高了近100倍。此外,经体外实验证明,Aglycin对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50(36.48μmol/L)比阿卡波糖(991.33μmol/L)低,说明Aglycin比阿卡波糖有更强的α-葡萄糖苷酶抑制活性,这进一步证明Aglycin有开发为α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜力。     

酶法制备花生α-葡萄糖苷酶抑制肽的工艺优化

为促进花生蛋白资源的开发利用及发挥花生肽的降血糖作用，采用碱溶酸沉法制备花生蛋白，并利用不同商品蛋白酶水解花生蛋白制备花生肽。以α-葡萄糖苷酶抑制率为评价指标，对蛋白酶进行了筛选。在此基础上，采用单因素试验和响应面试验对花生α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备工艺进行了优化。另外，考察了花生蛋白水解度和花生肽α-葡萄糖苷酶抑制活性的相关性。结果表明：与其他商品蛋白酶相比，胰蛋白酶制备的花生肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性最高；酶法制备花生α-葡萄糖苷酶抑制肽的最优工艺条件为将花生蛋白于95 ℃加热5 min进行预处理，采用胰蛋白酶水解，水解时间62 min，加酶量8.9%，底物质量浓度4.1 g/100 mL，在最优条件下花生肽α-葡萄糖苷酶抑制率达到(68.82±0.24)%，此时花生蛋白的水解度为10.09%；水解度在8.0%~11.5%范围内与花生肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性呈显著正相关。综上，花生蛋白经胰蛋白酶水解后得到的花生肽对α-葡萄糖苷酶具有显著的体外抑制活性。