脉冲电场作用下细胞膜可控电穿孔技术研究

为实现脉冲电场作用下细胞膜可控电穿孔技术,利用THU-PEF4(自制高压脉冲电源)系统,采用碘化丙啶PI和Sybr GreenⅠ对小球藻进行了荧光染色试验,在激光共聚焦显微镜下定性研究等效脉冲能量密度和电场强度对小球藻细胞穿孔率的影响;结合流式细胞仪对小球藻穿孔细胞进行计数分析,定量研究等效脉冲能量密度和电场强度对小球藻细胞穿孔率的影响规律。实验发现:在激光共聚焦显微镜下,小球藻细胞膜电穿孔率随场强和等效脉冲注入能量的增加而增加;230 kJ/L的脉冲注入能量密度下,2.5~4 MV/m场强区间内,电场强度每提升0.4~0.5 MV/m,小球藻细胞发生不可逆电穿孔的比例提升约15%;4 MV/m场强下,当注入能量230 k J/L时,小球藻细胞膜穿孔率89%;小球藻细胞的穿孔比例在一定范围内随电场强度基本呈线性关系,随等效脉冲注入能量密度的增加呈现先增加后趋于平缓的趋势。因此,可以通过控制电场强度和等效脉冲注入能量密度来实现脉冲电场作用下细胞膜可控电穿孔技术。     

陡脉冲电场对肝癌细胞线粒体跨膜电位的影响

为研究陡脉冲电场的凋亡效应,以人肝癌细胞为实验对象,采用激光共聚焦扫描显微镜观察陡脉冲电场作用下细胞内线粒体跨膜电位的实时变化。实验结果表明,陡脉冲电场能使线粒体跨膜电位下降,较高的电压峰值、较窄的脉冲宽度(600 V/100 ns)比较低的电压峰值、较宽的脉冲宽度(200V/1.6μs)能使线粒体跨膜电位更快地下降,并且在停止施加陡脉冲电场后线粒体跨膜电位仍然在不断下降,进而有可能使线粒体跨膜电位崩溃,从而诱导肝癌细胞凋亡,为陡脉冲杀伤肿瘤细胞提供了理论依据。     

ns级陡脉冲诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究

为进一步研究ns级陡脉冲诱导细胞的凋亡效应,以人卵巢腺癌SKOV3细胞为对象,进行了电场强度为10 kV/cm、脉宽为100 ns的陡脉冲实验研究。结果表明,通过流式细胞术观测发现早期凋亡率约22%;通过AO/EB荧光染色检测显示,早期凋亡细胞表现为细胞体积缩小,胞膜完整,浓聚成颗粒状,位于细胞的一侧,胞质浓缩,呈黄绿色荧光;晚期凋亡细胞体积缩小,胞膜完整,细胞核呈橙红色或红色荧光;细胞坏死时,细胞体积增大,呈不均匀的橙红色荧光,轮廓不清,已解体或接近解体。医学统计学和形态学特征表明ns级陡脉冲能诱导SKOV3肿瘤细胞发生凋亡。     

纳秒脉冲细胞内电处理机理及其研究进展

介绍了细胞内电处理效应的研究现状及其进展 ;重点描述了KarlHSchoenbach提出的脉冲电场与细胞相耦合的球形模型 ;探讨了细胞内电处理机理 ,即当脉冲作用于悬浮生物细胞时 ,随脉冲宽度变小 ,电场对细胞核及核膜影响增强 ,当脉宽大于细胞膜充电时间常数时 ,脉冲电场主要作用在细胞外膜上产生电穿孔 ;当脉宽小于细胞膜充电时间常数时 ,脉冲电场对细胞内进行电处理。     

双极性脉冲电压下介质阻挡放电及其涤纶表面改性

大气压下空气中介质阻挡放电(ADBD)在工业材料表面改性处理上具有广泛的应用前景。为研究陡前沿双极性脉冲电源在介质阻挡放电(DBD)均匀性及涤纶表面改性上的应用,在相同条件下采用脉冲电源放电与工频电源、高频电源DBD进行对比,分析了放电特性并测试了涤纶改性后的不同效果。用高速摄影仪拍摄了放电的快速曝光照片并记录了电压、电流波形;用扫描电镜、能谱仪等测量手段观察了涤纶纤维改性前后的表面形貌以及含氧量的变化;并比较了改性后芯吸性的改善情况。研究结果表明,采用双极性陡前沿的窄脉冲电源有利于在空气中实现较均匀、稳定的介质阻挡放电。     

高频双极性脉冲诱导SKOV–3细胞生物电效应的实验研究

不可逆电穿孔技术以其非热、微创的独特优势而广泛应用于肿瘤治疗领域,但在治疗过程中会出现消融不彻底与肌肉收缩这2个问题;高频双极性脉冲作为新式脉冲形式可在肿瘤组织中产生均匀电场来解决肌肉收缩难题,同时与传统脉冲相比能有效缓解肌肉收缩。为此,以SKOV–3细胞为研究对象,采用CCK–8检测细胞活性,采用JC–1荧光探针分子观察线粒体膜电位变化,采用免疫组化技术检测凋亡蛋白表达。研究发现：传统单极性脉冲对肿瘤细胞的杀伤机理主要是对细胞膜的不可逆破坏,继而导致细胞坏死;ns高频双极性脉冲虽然与传统脉冲具有相同的电场强度与高电平时间,但却不能有效杀死肿瘤细胞;而μs高频双极性脉冲不仅能有效诱导细胞坏死,而且通过活性检测发现也可能诱导细胞凋亡;进一步研究发现,μs高频双极性脉冲能作用于线粒体使线粒体膜电位崩溃;同时也检测出BAX、BCL–2、Caspase–3和Caspase–9凋亡蛋白的表达。该研究结果表明μs高频双极性脉冲不仅可诱导细胞坏死,而且可启动线粒体凋亡程序来杀死细胞。     

含色散和电穿孔效应的球形细胞在纳秒脉冲下的生物电效应仿真

为准确研究纳秒脉冲(nanosecond pulses electric field,ns PEF)作用下细胞跨膜电位的分布规律,采用多物理场仿真软件COMSOLMultiphysics建立球形细胞五层介电模型,同时引入色散(dispersion,DP)和电穿孔(electroporation,EP)效应来研究纳秒脉冲下的细胞生物电效应。结果表明,在电穿孔的基础上引入色散效应,使得细胞膜上点A1跨膜电位(trans-membranepotential,TMP)达到峰值的速度明显加快,核膜上点B1的跨膜电位在0～100ns区间明显增大;微孔密度、跨膜电位的时空变化结果表明,点A1首先在2ns左右发生电穿孔,随后点A2—A5依次发生电穿孔,最终细胞膜上至少2/3区域发生电穿孔。研究结果从理论上证明了只有同时引入色散和电穿孔效应才能正确预测纳秒脉冲的生物电效应。     

微/纳秒脉冲电场靶向不同尺寸肿瘤细胞内外膜电穿孔效应研究

为深入研究细胞物理特性对微/纳秒脉冲电场诱导的电穿孔效应差异,以三种不同细胞大小及两种不同细胞核大小的肿瘤细胞为研究对象,基于其细胞几何特征建立1:1五层介电及电穿孔数值模型,并观察其在微/纳秒脉冲电场作用下细胞内外膜的荧光消散情况,对微/纳秒脉冲电场诱导细胞内外膜电穿孔效应进行对比分析,研究微/纳秒脉冲电场靶向作用于不同几何尺寸细胞的敏感性差异机理。结果表明,在90个脉冲宽度为100μs、电场强度为1.5kV/cm的微秒脉冲作用下,细胞尺寸越大,细胞外膜穿孔区域、孔密度和荧光消散程度也越大,即诱导的细胞膜电穿孔效果更强。在80个脉冲宽度为400ns、电场强度为15kV/cm的纳秒脉冲作用下,细胞核尺寸越大,其细胞核膜的穿孔区域、孔密度和荧光消散程度也越大,即诱导的细胞核膜电穿孔效果更强。因此,微/纳秒脉冲电场对肿瘤细胞的作用靶区及尺寸大小具有明显的选择性。该研究可为消融不同肿瘤所需的脉冲电场参数提供数据参考与理论支撑。     

陡脉冲不可逆性电击穿治疗肿瘤的研究

为寻求更为有效的肿瘤治疗策略,通过对陡脉冲治疗肿瘤的电穿孔效应和内处理效应的国内外研究现状的分析,提出了陡脉冲不可逆性电击穿效应调控肿瘤细胞死亡和凋亡的创新思路。实验中肉眼和组织学、超微结构的观察首次证实陡脉冲能有效地杀伤肿瘤细胞,明显抑制了肿瘤的生长、增殖,延长了的生存期。基于重庆大学的最新研究提出了不同窗口参数的陡脉冲具有不同的生物电效应的设想,总结了利用陡脉冲不可逆性电击穿效应治疗肿瘤的新方法及目前的研究进展并提出了该技术走向临床需重点研究的内容及关键技术。     

细胞骨架在ns脉冲诱导肿瘤细胞凋亡中的作用

为了研究细胞骨架在ns脉冲诱导肿瘤细胞凋亡中的作用,将脉冲电场参数组合(电场强度10kV/cm,脉宽500ns,脉冲30个,频率1Hz)作用于细胞骨架裂解的Hep-G2细胞。利用Annexin-V和碘化丙碇(propidium i-odide,PI)双染法检测细胞凋亡和坏死情况;采用荧光分光光度计观测线粒体跨膜电位和细胞膜穿孔的变化情况。试验发现:肌动蛋白裂解后脉冲处理组的细胞凋亡和坏死大大降低(与单独脉冲处理组相比检验水平P<0.05),早期细胞凋亡由(16.94±2.87)%下降到(4.77±1.87)%;晚期凋亡和坏死由(20.94±3.09)%下降到(14.38±2.60)%;脉冲处理组和肌动蛋白裂解后脉冲处理组的细胞线粒体跨膜电位都出现下降,但后者的线粒体跨膜电位却明显高于前者(P<0.05);单独脉冲处理组和细胞骨架缺失后脉冲处理组二者在相同时间点时其PI荧光强度无明显差异,且PI荧光随时间而变化的规律亦相似。上述结果表明:细胞骨架的缺失抑制了ns脉冲诱导细胞凋亡的线粒体通路,进而降低细胞凋亡水平,但对细胞膜的穿孔情况无明显影响。