酶修饰研究进展

酶修饰技术可以提高酶的稳定性、催化效率、活力和延长半衰期等性质,使其更好的应用于当今食品、医药等行业。本文重点综述了蛋白质交联修饰、小分子化学修饰、辅助因子修饰等七种分子化学修饰方法和分子定向化修饰、定点突变修饰等三种基因工程修饰方法以及它们在食品、医药和化工行业的应用,并对酶修饰技术的发展前景进行了展望。     

多聚赖氨酸对双亚基肌酸酶表面的修饰

利用多聚赖氨酸(poly-lysine)对同源二聚体肌酸酶进行化学修饰,研究该法对酶稳定性的影响。选用L_9(3~4)正交试验方案,研究不同修饰条件对修饰酶的催化效率和热稳定性的影响,确定多聚赖氨酸修饰肌酸酶(CRE)的最佳条件为CRE-COOH与poly-lysine-NH_2、EDC的摩尔比分别为1∶100和1∶10,pH为7.0。通过SDS-PAGE鉴定,探测多聚赖氨酸可在酶分子表面产生共价结合。修饰酶的催化动力学参数Km和kcat分别为4.75×10~(-2)mol/L和2.50×10~2S~(-1)。与游离酶相比,修饰酶的热稳定性和pH稳定性均明显提高。修饰酶比游离酶的Tm值高了2.07℃,当pH值为4.0和10.0时,修饰酶的酶活力仍保留在50%以上,而游离酶活性几乎丧失。进一步优化研究表明,多聚赖氨酸表面修饰法有可能成为有效提高肌酸酶稳定性的一种方法。     

生姜蛋白酶的大分子结合修饰

采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)和右旋糖苷对生姜蛋白酶进行大分子结合修饰。在酶液质量浓度为2.0mg/mL的硼酸缓冲液中,加入三聚氯氰活化的mPEG 或高碘酸钠活化的右旋糖苷,于40℃修饰反应1h,对修饰剂与酶蛋白的质量比和pH 值条件进行优化：mPEG 与酶的质量比为17.5:1.0、pH9.0,mPEG 修饰酶的修饰率为52.6%,相对酶活力(修饰酶活力/ 天然酶活力)为54.0%;右旋糖苷与酶的质量比为42:1、pH6.0,右旋糖苷修饰酶的修饰率为51.6%,其相对酶活力为原天然酶的3.3 倍。两种修饰酶的热稳定性均比天然酶显著增强,且右旋糖苷修饰酶的热稳定性明显高于mPEG 修饰酶。结果表明：右旋糖苷对生姜蛋白酶的修饰效果优于聚乙二醇,适用于酶蛋白的化学修饰与新型酶制剂的开发利用。     

月桂酰氯修饰羊血超氧化物歧化酶工艺优化及酶学性质

以羊血为材料获得超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）酶液,采用月桂酰氯修饰SOD,在修饰温度、修饰时间、月桂酰氯添加量和丙酮添加量的单因素试验基础上,通过正交试验优化工艺参数,并比较修饰酶与天然酶的酶学性质。结果表明：10 mL酶比活力为4 348.6 U/mg的SOD样液在修饰温度60 ℃、修饰时间30 min、月桂酰氯用量0.1 mL、丙酮添加量为酶液体积的1.5 倍条件下充分反应,所得修饰酶活力最强;修饰酶热稳定性、pH值耐受性、半衰期等均优于天然酶。月桂酰氯可用于修饰性能较优的羊血超氧化物歧化酶。     

磷脂酶的CC-mPEG化学修饰条件优化及其酶学性质影响

以氰尿酰氯活化的单甲氧基聚乙二醇(CC-mPEG)为修饰剂,研究修饰条件对磷脂酶A1(PLA1)修饰率和酶活力的影响以及修饰前后酶学性质的变化。结果表明:当修饰条件为温度25℃、修饰时间2 h、摩尔比10时,修饰酶(MPLA1)的修饰率为14.3%,酶活力保留了90.4%,与修饰前的PLA1相比,MPLA1的热稳定性和贮藏稳定性均有所提高,催化效率提高了1.73倍。     

阿魏酸化学修饰溶菌酶及扩展抑菌谱的研究

为了使溶菌酶扩展抑菌谱,同时作用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,本文采用了阿魏酸修饰溶茼酶.采用EDAC作为缩合剂,使溶菌酶赖氡酸残基上的ε-氨基共价结合阿魏酸的羧基,形成一定程度的阿魏酸修饰酶结果显示:与天然溶菌酶相比,修饰酶的酶活力略有下降,但是修饰酶扩展了抑菌谱,对革兰氏阴性菌的抑菌作用增强.修饰酶对大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度均为0.5mg/mL,而对金黄色葡萄球菌的抑菌作用略有下降.     

酶法修饰对乳蛋白功能性质的影响

该试验研究了酶法修饰对乳蛋白功能性质的影响。乳清蛋白的单酶和双酶修饰产物的乳化活性并没有显著的升高或降低,但乳化稳定性相比于原料乳清蛋白分别下降了18.1%和28.55%。脱脂乳粉的2种酶修饰产物的乳化活性及乳化稳定性都与原料脱脂乳粉基本保持同一水平,无明显差异。模拟体外消化过程检测结果显示,与原料乳清蛋白相比,经酶法修饰后的乳清蛋白产物一步消化和两步消化后释放的肽量均有所增加,并且单酶修饰乳清蛋白比双酶修饰乳清蛋白的消化性更好。疏水性检测结果显示,单酶体系和双酶体系修饰的乳清蛋白和脱脂乳粉的表面疏水性都明显高于相应的原料蛋白,其中,单酶体系修饰的乳清蛋白表面疏水性要比双酶修饰乳清蛋白略高,而双酶体系修饰脱脂乳粉高于单酶体系修饰脱脂乳粉,结果与固有荧光性分析的结果一致。该研究目的是确认单酶及双氧化酶体系修饰乳蛋白的可行性,阐明其对乳蛋白功能性质的影响,为乳蛋白功能性质的改善提供一种新途径,对拓宽乳蛋白在食品加工产业中的应用具有实际的理论指导意义和应用价值。     

褐藻胶多糖分子修饰酶的研究进展

褐藻胶作为一种线性多糖根据其结构和组成差异具有不同的生理生化特性,在食品、医药和化妆品等领域有着巨大的应用价值和潜力。褐藻胶的这些特性主要通过褐藻胶修饰酶如褐藻胶裂解酶、甘露聚糖C5差向异构酶、褐藻胶乙酰化酶和褐藻胶脱乙酰化酶的作用控制。作者主要概述了褐藻胶修饰酶合成和修饰褐藻胶的作用机理,总结了几种褐藻胶修饰酶的来源、分类、结构、作用方式和研究进程,重点阐述了褐藻胶裂解酶和甘露聚糖C5差向异构酶的相关研究进展,并对相关研究的未来发展提出展望,可为进一步开发和应用褐藻胶及其相关修饰酶提供借鉴和参考。     

乙醇溶液体系中Span修饰猪胰脂酶的研究

在乙醇-水溶液体系中采用Span系列表面活性剂对猪胰脂酶进行了修饰,以其催化酯交换的交换量为指标衡量修饰的效果,并且比较了修饰酶与未修饰酶的热稳定性差异。结果表明：40℃下30min即可完成Span对猪胰脂酶的修饰,但各种表面活性剂修饰的最佳条件并不相同。Span20修饰脂肪酶的最佳条件是水与乙醇的比例为4：1（v/v）,Span20用量为25%;Span40修饰猪胰脂酶的最佳条件是水与无水乙醇的比例为2：1（v/v）,Span40用量为20%;Span65修饰猪胰脂酶的最佳条件为水与无水乙醇的比例为1：1（v/v）,Span65的用量为20%;Span60、Span80和Span85修饰脂肪酶的最佳条件是水与无水乙醇的比例为3：1（v/v）,用量均为20%。通过修饰后酶的热稳定性实验可以看出,六种表面活性剂修饰的酶在30～70℃间催化反活性都高于未修饰酶,在40℃下,修饰酶的催化活性基本达到最高,而未修饰酶要70℃才能达到最高催化活性。Span60修饰脂肪酶的效果优于其它五种表面活性剂。     

木聚糖酶热稳定性化学修饰研究

采用不同化学修饰剂对毕赤酵母工程菌所产的木聚糖酶进行化学修饰,结果发现用聚乙二醇(diamino-PEG)对酶进行的化学修饰,提高了酶的热稳定性。通过对化学修饰木聚糖酶条件的优化,最终确定了修饰反应体系中,木聚糖酶、diamino-PEG和偶联剂(EDAC/NHS试剂)的摩尔比为1∶1 000∶100。该修饰反应得到的修饰酶,在55℃保温10 min后,残余酶活力为61.6%,比原酶提高了29.1%,通过对酶学性质的分析,发现修饰酶只有pH稳定性、热稳定性发生了改变。