产普鲁兰酶蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及酶学性质研究

利用选择性培养基从广西南宁淀粉加工厂附近土壤中分离出一株具有产普鲁兰酶能力的野生菌株GXBC-2。该菌株革兰染色为阳性,形成芽孢,菌体细胞杆状,结合生理生化特征和16S rDNA序列分析,初步鉴定该菌株为Bacillus cereus GXBC-2。对该菌所产普鲁兰酶的性质研究表明:酶的最适反应温度为50℃,在30～50℃范围内稳定,最适pH为7.0,稳定pH范围为6～8.5。产物经HPLC分析证明,该酶能水解普鲁兰糖产生麦芽三糖,对可溶性淀粉不起作用,所以该酶属于I型普鲁兰酶。     

一株产普鲁兰酶菌株的筛选鉴定、酶学性质及海带多糖酶解产物的抗氧化活性

本研究从连云港海泥中筛选产普鲁兰酶菌株,利用形态学、生理生化特征、基因序列(16S rRNA和 gyrB)进行分析鉴定。利用产酶菌株发酵制备普鲁兰酶,初步纯化后分析其酶学性质。利用该普鲁兰酶粗提物对海带多糖进行水解,并对其水解产物进行抗氧化活性分析。结果表明:筛选得到一株产普鲁兰酶的巨大芽孢杆菌P6(Bacillus megaterium),经发酵纯化后普鲁兰酶比活力为62.3 U/mg,分子量约为43 kDa。该酶的最适反应温度为45 ℃,最适pH为6.5,在温度40 ℃下保温5 h,相对残余酶活达95%以上,而60 ℃下保温1 h,酶全部失活。在pH6~7.5之间保温12 h后,该酶仍有40%以上的相对残余酶活。DPPH和·OH自由基清除实验表明:海带多糖经普鲁兰酶水解后抗氧化活性显著增强(p<0.05),为普鲁兰酶在食品工业中的应用研究提供了新的方向。     

嗜冷普鲁兰酶产生菌NX-1的筛选及产酶条件优化

从南极海泥样品中分离得到一株产嗜冷普鲁兰酶的假交替单胞菌菌株（Pseudoalteromonas sp.）NX-1。以菌株NX-1为研究对象,对菌株NX-1产嗜冷普鲁兰酶的酶学性质进行了初步研究,并通过单因素试验和正交试验对其产嗜冷普鲁兰酶的最佳培养条件进行研究。结果显示,菌株NX-1所产嗜冷普鲁兰酶的最适作用温度为20 ℃,最适作用pH值为7.0,在最适条件下,酶的半衰期约为120 min;菌株NX-1的最适产酶条件为：培养温度20 ℃、接种量1%、培养基各组分含量分别为蔗糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、CaCl2 0.5 g/L、Na2HPO4 6 g/L。优化后菌株产酶可达25.172 U/mL,相比优化前提高25.1%。     

产耐热普鲁兰酶菌株的分离、筛选与鉴定

从某火山口的土壤样品中分离筛选得到了一株产耐热普鲁兰酶菌株T-10,酶活力为1.22 U/m L。经形态特征观察、生理生化特征实验以及16S r DNA序列同源性分析,确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。酶学性质研究表明:该普鲁兰酶的最适温度是60℃,在70℃保温4 h后活力残留60%以上;最适p H值为6.0,p H 3.0~8.0在室温保存4 h后相对酶活力大约为70%。目前,鲜有发现产耐热普鲁兰酶的菌株为解淀粉芽孢杆菌,其具备良好的应用前景。     

酸性普鲁兰酶基因在地衣芽孢杆菌中的表达

根据Genbank公布的来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因突变体序列(AX203843)合成普鲁兰酶成熟肽基因。将该基因插入芽孢杆菌分泌型表达载体pHY-WZX,重组质粒转化地衣芽孢杆菌B60608,重组地衣芽孢杆菌实现普鲁兰酶分泌表达。对重组菌产普鲁兰酶的条件进行优化,以含2%药媒和8%甘油的培养基最适合普鲁兰酶表达。     

嵌合突变嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶结构域B对酶学性质及功能的影响

为考察嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)普鲁兰酶结构域B对热稳定性及其他酶学特性和功能的影响,采用嵌合蛋白技术将B.acidopullulyticus普鲁兰酶的结构域B置换为Geobacillus thermoleovorans普鲁兰酶结构域B。嵌合突变体在60℃下的半衰期由34.9 min提高至168.4 min,解折叠一半时的温度由65℃提高至72℃,嵌合突变体较野生型具有更加优良的动力学稳定性和热动力学稳定性。结构域B置换后,最适pH碱向偏移至pH6.5,最适温度提高至70℃。比酶活及底物特异性实验结果显示,嵌合突变削弱了酶分子与普鲁兰多糖的结合,转而有利于与糊精及可溶性淀粉的结合。淀粉糖化结果显示,嵌合突变不影响突变体的实际应用性能。上述结果表明,B.acidopullulyticus普鲁兰酶结构域B对酶蛋白酶学性质影响显著,可通过同源置换构建适合于不同淀粉糖化工艺的突变体。     

蔗糖酶产生菌的分离鉴定及酶学性质的研究

以蔗糖为唯一碳源筛选培养基,从高糖土壤筛选出1株分离出一株产蔗糖酶活力较高的细菌菌株,编号为L23。根据生理生化特性和16S rDNA序列,将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。对该菌所产蔗糖酶的性质研究结果表明:酶的最适pH为3.6,最适反应温度为40℃,在30~40℃范围内稳定。     

短小芽孢杆菌热稳定环糊精葡萄糖基转移酶粗酶酶学特性研究

从土壤分离物中筛选到一株环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucanotransferase,CGTase)产生菌CGT01.16SrDNA序列分析表明该菌与短小芽孢杆菌(Bacillus pumnilus)的同源性为99%.同时根据其生理生化特征,该菌株被鉴定为短小芽孢杆菌(B.pumilus).命名为B.pumilus.CGT01菌株.产生CGTase的最适初始pH为6.5,最适培养温度为37℃.菌株所产CGlke的最适pH值和最适反应温度分别为pH 6.5和60℃,并有较高的热稳定性.60℃条件下保温,酶活基本稳定,半衰期为35 min.酶液中添加1 mmol/L Ca2+能明显提高CGTase的稳定性,60 ℃保温1 h后,剩余酶活仍达80%以上.SDS-PAGE检测表明酶的分子量约为78 ku左右.经高效液相色谱分析表明,CGTase作用于可溶性淀粉后的主要产物为葡萄糖、麦芽糖和β-环糊精,没有检出α和γ型环糊精产物,因此所产环糊精为单一类型,不同于同种属的其他菌株所产CGTase.     

响应面法优化巨大芽孢杆菌Y103产普鲁兰酶的培养条件

在玉米秸秆腐殖质土壤中筛选分离得到一株巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）Y103,采用单因素试验、响应面法优化巨大芽孢杆菌Y103产普鲁兰酶的培养条件。结果表明,最佳培养基配方为糯米淀粉8.5 g/L,酵母膏13.3 g/L,蛋白胨 26.7 g/L,KH2PO4 0.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.1 g/L,MnSO4·7H2O 0.05 g/L,NaCl 2.0 g/L。最佳发酵条件为初始pH8.8,发酵温度21 ℃,发酵时间55 h。在最优条件下,普鲁兰酶酶活力为（0.77±0.03） U/mL,是优化前的3.21倍。该酶的最适作用温度为50 ℃,最适pH为8.0,其水解普鲁兰糖的产物中有大量麦芽三糖和麦芽六糖,表明其为一种新颖的II型普鲁兰酶,在洗涤剂、高麦芽糖浆和麦芽六糖的生产中有着潜在的巨大利用价值。     

耐高温β-葡聚糖酶产生菌株的筛选及酶学性质的研究

从云南安宁温泉周围土壤中筛选到1株热稳定性能较好的β-葡聚糖酶产生菌W-9.其发酵条件及酶学特性为:发酵 72h,在pH6.0、70℃条件下,酶活性为82.64u/mL.分子生物学及其生理生化鉴定,该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).W-9产β-葡聚糖酶的酶学性质结果显示,其产β-葡聚糖酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为70℃,在70℃条件下保温时,酶活基本稳定.     

产淀粉酶芽孢杆菌的分离鉴定、高温驯化及酶学性质研究

该研究从酱香型高温大曲中筛选出产淀粉酶芽孢杆菌，对筛选菌株进行形态学观察、分子生物学鉴定以及高温驯化，并针对驯化前后所产淀粉酶进行酶学性质研究。结果表明，分离筛选到的产淀粉酶菌株Amy Z5为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，在45℃培养条件下生物量及淀粉酶活性有较大幅度降低。菌株Amy Z5经高温驯化，生长温度提高至45℃，并缩短对高温环境的适应期，培养3 h时OD_{600 nm}值即提高4.2倍。高温驯化后的菌株HTAmyZ5所产淀粉酶的最适反应温度从40℃提高至70℃，最适反应pH仍为3，在20～90℃及pH 1～7条件下酶活均能保持在60%以上，pH 9时仍有40%的酶活；最高酶活性提高了3.1倍，达到322.1 U/m L；但稳定性受到高温环境影响略有下降。该研究对酱香型大曲微生物高温发酵、原料高效持久利用及关键香气成分的形成均具有一定的参考意义。     

海洋源蛋白酶产生菌筛选及酶学特性的初步研究

从海洋源鱿鱼中筛选高产蛋白酶菌株。通过检测蛋白酶产生水解圈结合蛋白酶活性测定的方法筛选高产蛋白酶菌株,采用PCR技术对筛选菌株进行16S rRNA鉴定,并构建目的菌株的系统发育树,同时研究粗蛋白酶的酶学特性。结果表明:筛选得到的10株产蛋白酶活力较高的菌株,经鉴定分别属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、普罗威登斯菌属(Providencia sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。其中SW5菌株产酶活性最高达257.67±2.44 U/mL,为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。该菌株所产粗蛋白酶的酶学特性研究发现,其最适pH为8.0,最适温度为40℃,终离子浓度为1 mmol/L时Mn2+、Ba2+和Ca2+对该蛋白酶活性有较高的激活作用,而Fe~(2+)和Zn~(2+)能明显抑制该蛋白酶活性。     

产胶原蛋白酶菌株的构建及性质分析

使用聚合酶链式反应(PCR)法扩增了解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens TCCC11319)的胶原蛋白酶基因col,并在枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtillis WB600)中进行表达。收集重组菌株的发酵酶液,以此来分析胶原蛋白酶性质。酶学性质研究表明:酶的最适反应温度为40℃,在30~40℃具有良好的温度稳定性;最适反应p H值为8.0,在pH值7.0~8.0的条件下稳定,表明是一种中性酶;金属离子Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶有明显的激活作用,而Mn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)对酶有明显的抑制作用,其中Cu~(2+)对酶的抑制作用最显著。酶学性质的研究结果对胶原蛋白酶在制革固体废弃物处理应用中具有很好的指导意义。     

酸性异淀粉酶产生菌的筛选及鉴定

从淀粉厂附近的土壤中分离出产脱枝酶的菌株,通过初筛和复筛,得到1株产偏酸性异淀粉酶活力较高的菌株YDF30。其发酵56h时酶活力最大,达到16．4U/mL。所产生的异淀粉酶最适反应温度为55℃,最适pH值为5．2,在低于50℃和pH5．2～9．6条件下较稳定。依据其形态特征和生理生化实验结果,初步鉴定该菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp．)。     

普鲁兰酶产生菌的分离与鉴定

以淀粉工业用普鲁兰酶的开发为目的，采集全国不同地区的土壤样本，分离其中的嗜中温细菌，经过形态学鉴定后，通过16SrDNA最终确定其属种并建立细菌库。对该细菌库中短短芽胞杆菌所产普鲁兰酶进行了初步的酶学研究，研究表明野生短短芽胞杆菌的初始酶活都很低，有几株其初始产酶水平大于1U／mL。酶学性质研究表明，短短芽胞杆菌普鲁兰酶有较好的应用价值，其最适作用pH在4～6之间，最适作用温度在50℃～60℃之间，其中来源于CICIM B1490的普鲁兰酶，其酶学性质与目前使用黑曲霉糖化酶的酶学性质相似，能够作为以后研究的初发菌株。     

产胶原蛋白酶菌株的构建及性质分析北大核心

使用聚合酶链式反应(PCR)法扩增了解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens TCCC11319)的胶原蛋白酶基因col,并在枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtillis WB600)中进行表达。收集重组菌株的发酵酶液,以此来分析胶原蛋白酶性质。酶学性质研究表明:酶的最适反应温度为40℃,在30~40℃具有良好的温度稳定性;最适反应p H值为8.0,在pH值7.0~8.0的条件下稳定,表明是一种中性酶;金属离子Ca^(2+)、Mg^(2+)对酶有明显的激活作用,而Mn^(2+)、Cu^(2+)、Fe^(2+)对酶有明显的抑制作用,其中Cu^(2+)对酶的抑制作用最显著。酶学性质的研究结果对胶原蛋白酶在制革固体废弃物处理应用中具有很好的指导意义。     

启动子替代构建克雷伯氏菌普鲁兰酶高产菌株

应用启动子替代技术将普鲁兰酶产生菌克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)HN9的普鲁兰酶基因的启动子替换为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的P43启动子,构建高产酶菌株。通过融合PCR,将由3个DNA片段融合得到启动子替代同源重组片段,该3个DNA片段分别是带有克雷伯氏菌普鲁兰酶基因启动子上游部分同源序列的四环素抗性基因(Tet)的上游片段Tet1、带有枯草芽孢杆菌P43启动子部分上游同源序列的Tet下游片段Tet2和带有克雷伯氏菌普鲁兰酶基因上游同源序列的P43启动子部分序列的Pro。经电转化将同源重组片段导入克雷伯氏菌中,转化子的普鲁兰酶基因表达水平比出发菌株提高10.23~11.45倍,摇瓶发酵酶活力提高8.97~10.52倍。结果表明,应用高效组成型启动子P43替代原始菌株的普鲁兰酶基因的启动子能够显著提高普鲁兰酶基因的表达量和发酵酶活力。     

一种中性普鲁兰酶及其在红薯粉丝制作中的应用

本研究旨在开发一种在较宽泛的pH范围内活性稳定的中性普鲁兰酶,以适应以红薯面为原料的粉丝制作工艺。以地表地芽孢杆菌（Geobacillus subterraneus） XQ3665基因组DNA为模板,经PCR扩增得到普鲁兰酶基因pul3665,并实现了异源表达。重组酶PUL3665纯酶比酶活为32 U/mg,最适反应温度55 ℃,最适pH为6.5,在pH 5.5~7.5 范围内酶活保持在最高酶活的80%以上。PUL3665降解普鲁兰多糖的产物为麦芽三糖,不降解可溶性直链淀粉,是一种I型普鲁兰酶。在以不同pH值的红薯面为原料的粉丝制作工艺中,按每克芡糊淀粉2 U的量添加枯草芽孢杆菌表达的PUL3665粗酶液处理芡糊,均能在不添加明矾或其它添加剂的条件下制作出粉丝,且成品粉丝质量与添加明矾获得的粉丝基本一致。PUL3665有希望开发成一种用量小,使用效果稳定的新型明矾替代物。     

普鲁兰酶产生菌的筛选

从啤酒厂附近的土壤中分离产脱枝酶的菌株,通过筛选得到一株产普鲁兰酶的菌株PUG12.对其产酶条件进行了初步优化,其发酵64 h时产酶活力最大,达到2.45 U/mL.初步研究了酶性质,其产生的普鲁兰酶反应最适温度为45℃,反应最适pH为8.2,在50℃以下和pH6.4～9.4条件下较稳定.     

嗜热古菌Thermococcus sp.HJ21产高温普鲁兰酶条件和酶学性质

对一株分离自热液口的超嗜热古菌(Thermococcus sp. HJ21)菌株产普鲁兰酶的条件及酶学性质进行了研究.结果发现:该菌株在18 h产酶量达到最高.在发酵温度为88 ℃、培养基初始pH 6.5,以及NaCl质量浓度为2.5 g/dL时,产酶较高.麦芽糖、酵母粉和蛋白胨有利于普鲁兰酶的产生.该酶的最适作用温度为95 ℃,在80～100 ℃之间仍可保持较高的酶活性;该酶具有较好的热稳定性,100 ℃保温2 h,仍有50%以上的残余酶活.该酶的最适作用pH为6.0,并且在pH 5.0～7.0之间可以保持较高酶活性;在pH 5.0～7.0之间较稳定,在pH 6.5时稳定性最好.Ca2+和Na+对普鲁兰酶具有较强的激活作用,而Al3+、Ni2+、Hg2+、Cu2+等则强烈抑制酶的活性.