基于群体感应研究苦丁茶多酚对荧光假单胞菌腐败特性的抑制作用

为探究苦丁茶多酚对分离自卵形鲳鲹的腐败菌荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的抑制作用,本文以报告菌株紫色杆菌(Chromobacterium violaceum) CV026 为检测模型,测定了苦丁茶多酚对细菌的群体感应抑制活性,以胞外酶活性、生物被膜形成量及形态、群集与泳动性为指标,测定了苦丁茶多酚对荧光假单胞菌腐败特性的抑制作用。结果表明:苦丁茶多酚对CV026、荧光假单胞菌的最小抑菌浓度分别为2.1、3.0 mg/mL;在亚抑菌浓度下,苦丁茶多酚可以显著降低紫色杆菌CV026 紫色菌素的产生量（P<0.05）;当浓度为2.0 mg/mL 时,对紫色菌素的抑制率达68.89%,且不影响CV026 菌株的生长;苦丁茶多酚能有效抑制荧光假单胞菌胞外酶活性、生物被膜形成、群集与泳动能力等相关腐败特性,其抑制作用呈剂量依赖性,苦丁茶多酚浓度为2.0 mg/mL时,对蛋白酶、脂肪酶活性、生物被膜形成、群集和泳动能力的抑制率分别达到80.68%、53.50%、44.90%、79.56%和90.12%;苦丁茶多酚具有较好的群体感应抑制活性,可以为新型天然群体感应抑制剂研发提供参考。     

肉桂油对大菱鲆荧光假单胞菌腐败能力的抑制作用

利用报告菌株紫色杆菌CV026检测模型,验证肉桂油具有群体感应抑制活性。以大菱鲆灭菌鱼汁为研究对象,接种荧光假单胞菌后,经3μL/m L肉桂油处理并于4℃下贮藏,每隔24 h测定细菌菌落总数、荧光假单胞菌落数、TMA和TVB-N,结合感官评价,研究肉桂油对荧光假单胞菌腐败能力的抑制作用。结果表明:肉桂油能够显著减缓鱼汁感官品质的下降（p<0.05）,有效降低鱼汁的TMA和TVB-N（p<0.05）,但不影响荧光假单胞菌的生长。可见,肉桂油可以通过干扰荧光假单胞菌的群体感应系统,来降低其腐败能力,并且这种效果不是利用抑菌作用来实现的。      

群体感应AHLs对温和气单胞菌体外致腐因子分泌的影响

以大菱鲆腐败菌温和气单胞菌(Aeromonas sobria,AS7)为研究对象,研究了不同处理方式(营养基质、共生培养和添加不同种类的AHLs)对温和气单胞菌的致腐因子(嗜铁素、胞外蛋白酶、生物被膜)产生情况的影响,结果表明,菌株AS7嗜铁素的分泌受到培养基质的影响,在脱脂牛奶等天然基质中可以大量分泌嗜铁素,而市售的合成培养基中不能分泌嗜铁素;AHLs的添加对嗜铁素的产生量有影响,其中,C8-HSL影响显著,随添加的增加,嗜铁素分泌量呈现正相关(P0.05),而C6-HSL影响不显著(P0.05);共生条件下,温和气单胞菌对荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌嗜铁素的分泌有明显促进作用;AHLs的添加可以促进温和气单胞菌胞外蛋白酶和生物被膜的产量,且呈现正相关(P0.05),说明AHLs对温和气单胞菌产生胞外蛋白酶、嗜铁素和生物被膜具有调控作用。     

绿原酸对荧光假单胞菌群体感应现象及其腐败特性的抑制作用

首先以群体感应报告菌株紫色杆菌CV026检测模型,确定绿原酸的群体感应抑制活性,结合HPLC-MS/MS检测其对荧光假单胞菌释放信号分子的影响。以胞外酶活性、嗜铁素、群集与泳动为评价指标,通过添加外源信号分子分析绿原酸对荧光假单胞菌群体感应活性及腐败特性的调控作用。结果表明:在不影响荧光假单胞菌正常生长的剂量下,绿原酸可以减少其信号分子的产生,明显抑制荧光假单胞菌嗜铁素的产生、胞外蛋白酶、胞外脂肪酶活性、群集与泳动等相关腐败特性,且随着绿原酸浓度的升高,抑制效果更趋明显。因此,绿原酸具有较好的群体感应抑制活性,该研究为绿原酸作为群体感应抑制剂的开发提供了理论支持。     

固定化青霉素酰化酶对荧光假单胞菌群体感应的抑制作用

水产品腐败菌的群体感应现象是加速水产品腐败的原因之一。近年来,由于化学保鲜剂的使用导致许多腐败菌产生抗性,并且其安全性也令消费者担忧,因此研究安全、高效的生物保鲜剂是水产保鲜中的重要课题。本研究用固定化青霉素酰化酶来抑制水产品优势腐败菌——荧光假单胞菌的群体感应现象。利用CV026验证固定化青霉素酰化酶对荧光假单胞菌AHLs的淬灭作用;利用光学显微镜和扫描电镜研究酶对生物被膜的影响;利用牛奶琼脂平板验证胞外蛋白酶的活性;通过分子对接预测酶与不同AHLs的相互作用。结果表明,固定化青霉素酰化酶能够降低荧光假单胞菌AHLs的含量,从而减少紫色杆菌CV026紫色菌素的生成,减缓荧光假单胞菌生物被膜和胞外聚合物的形成。同时也干预了胞外蛋白酶的产生,当酶质量浓度为15 mg/mL时无法观察到明显的蛋白抑制圈。分子对接结果显示,该酶与短链和长链的信号分子都能成功对接,然而,更偏向于长链AHLs。3D对接结果显示,C14-HSL被活性中心周围的氨基酸残基全部包裹,相互以氢键连接,氢键的数量较多,结合作用更强。由此说明固定化青霉素酰化酶具有良好的群体感应淬灭活性,可作为新型保鲜剂应用于水产品保鲜。     

鱼源荧光假单胞菌生物被膜形成和致腐表型的研究

荧光假单胞菌是养殖鱼类低温贮藏中的优势腐败菌。本研究比较分析5种荧光假单胞菌的生物被膜形成和腐败表型。采用结晶紫法、苯酚硫酸法、珠涡流法和荧光显微镜观察荧光假单胞菌的生物被膜形成和粘附能力,并测定细菌泳动性、蛋白酶活性、嗜铁素等致腐表型。结果表明,5株荧光假单胞菌在28℃LB肉汤中生长良好,经24 h培养后气-液界面上出现较厚的膜,在微孔板中生物被膜形成较快,其中鱼源PF01、PF06、PF07和PF10分离株在12 h含量最高,而标准菌株PFuk4在18 h最高。随着培养时间延长,细菌胞外多糖的含量逐步积累,在18～24 h达到最高,并较快粘附到不锈钢片表面,其中PF07的粘附量最高。5株荧光假单胞菌还具有较强的泳动性和蛋白酶活性,且均产嗜铁素。在PF07和PFuk4中还检测出短链高丝氨酸内酯(AHLs)活性,可能与其较高的被膜、粘附能力、泳动性及蛋白酶活性有关。本研究结果为从AHLs角度探究荧光假单胞菌的致腐机理打下良好的基础。     

氯化钙对食品致腐荧光假单胞菌生物被膜形成的影响

研究氯化钙（CaCl2）对食品腐败株荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）生物被膜形成特征的影响。采用结晶紫法、菌体计数、苯酚-硫酸法、共聚焦扫描显微镜和实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测Ca2＋对荧光假单胞菌的生物被膜形成、多糖分泌、被膜结构及相关基因表达的影响。结果表明,0.1 mmol/L Ca2＋刺激荧光假单胞菌生物被膜,随着浓度增加被膜形成增强,其中1 mmol/L促进最明显,而高于10 mmol/L作用减弱,并且Ca2＋不影响浮游细菌生长;同时,0.1 mmol/L和1 mmol/L Ca2＋对胞外多糖、薄膜和泳动性均呈现促进效果,而高浓度下呈现抑制;共聚焦扫描显微镜观察荧光假单胞菌对照组、1 mmol/L和20 mmol/L Ca2＋处理组的成熟生物被膜厚度分别为20.0、40.0 μm和25.0 μm,其中添加1 mmol/L Ca2＋显著增加PF07被膜厚度、菌体和胞外聚合物分泌量,使被膜结构更致密;实时荧光定量PCR检测显示,1 mmol/L Ca2＋刺激菌体黏附素lapA、藻多糖alg、鞭毛flgA基因表达量增加3～4 倍,并且Ca2＋均显著刺激AHLs合成酶luxI基因的表达,提示Ca2＋影响生物被膜与群体感应密切相关。可见,食品介质中CaCl2通过影响菌体黏附行为、胞外分泌物、基因表达导致荧光假单胞菌生物被膜形成特征和结构的改变,该研究为复杂的食品介质中腐败菌生物被膜形成和黏附提供依据。     

肉桂醛对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用

本文拟研究肉桂醛在非抑菌浓度条件下对荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）FML05-2生物膜形成的抑制作用。首先测定了肉桂醛对模式细菌紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）CVO26紫色素产生的影响;再对荧光假单胞菌FML05-2形成的生物膜以及与生物膜形成有关的重要因素胞外多糖进行了测定。结果表明:在非抑菌浓度40、20μg/m L条件下,肉桂醛对紫色杆菌CVO26紫色素的产生具有抑制作用,抑制率分别为31.53%、17.90%;对荧光假单胞菌FML05-2生物膜形成的抑制率分别为44.22%、21.77%;对荧光假单胞菌FML05-2胞外多糖产生的抑制率分别为15.72%、5.34%。因此,肉桂醛在非抑菌浓度条件下对荧光假单胞菌FML05-2生物膜的形成具有抑制作用。      

外源AHLs培养下荧光假单胞菌qPCR内参基因的筛选

目的：荧光假单胞菌是冷藏食品的优势腐败菌,其致腐基因受到群体感应系统的调控。为了准确定量腐败基因的表达,研究群体感应调控食品腐败的机制,需筛选荧光假单胞菌的内参基因。方法：以荧光假单胞菌PF-08为研究对象,选择8个常见的内参基因（dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16S rRNA）,添加不同类型群体感应信号分子培养后,利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测其基因表达量,采用geNorm、Normfinder、BestKeeper和RefFinder综合评估候选内参基因的表达稳定性,筛选最适内参基因。结果：在不同类型外源信号分子培养下,荧光假单胞菌中Ct值变化程度最小的是gltA,16S rRNA的Ct值过低;geNorm分析表达最稳定的内参基因是atpD和rpoD,且二者联用能准确定量目的基因表达水平;Normfinder和BestKeeper的分析结果都显示gltA是最稳定的内参基因;进一步用RefFinder综合评估,内参基因中表达较稳定的是rpoD和gltA。结论：rpoD和gltA在荧光假单胞菌经不同QS信号分子处理后均稳定表达,可用于...     

荧光假单胞菌胞外蛋白酶的纯化及特性研究

采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换层析、Sephacryl S-100 HR凝胶过滤层析方法对从原料乳中分离出一株荧光假单胞菌胞外耐热蛋白酶进行纯化及特性研究。将纯化后的单一蛋白酶进行SDS-PAGE分子质量测定,并考察最适温度、最适pH值、热稳定性、金属离子对其酶活性的影响及对该蛋白酶的氨基酸种类分析。纯化后蛋白酶的分子质量为47kD,经纯化后蛋白酶比活力提高了近61.38倍;最适温度和pH值分别为30℃和7.0;二硫苏糖醇对蛋白酶活性具有一定的抑制作用,Fe2+可以促进蛋白酶活性的提高;该酶具有较强耐热性,原酶液经130℃热处理3min后,残留酶活仍超过原酶液的47.67%;该蛋白酶氨基酸组成中甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和谷氨酸(Glu)的含量占明显优势,其中Gly含量最高,物质的量分数高达42%。     

乳酸菌细菌素Lac-B23对荧光假单胞菌及其生物膜的抑制作用

细菌素Lac-B23是由植物乳杆菌Lactobacillus plantarum B23产生的具有广谱抑菌活性的小分子肽,对嗜冷腐败菌荧光假单胞菌具有明显的抑制作用。细菌素Lac-B23对荧光假单胞菌的抑菌作用研究结果表明,细菌素Lac-B23可以使荧光假单胞菌胞内无机磷和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)发生不同程度的泄漏;细菌素Lac-B23首先破坏荧光假单胞菌的细胞外膜,然后消散了荧光假单胞菌细胞内膜跨膜电位(Δφ)和pH值梯度(DpH),细胞外膜渗透性增强,使细胞膜形成孔道。扫描电子显微镜和透射电子显微镜结果表明荧光假单胞菌细胞形态完整性发生改变,细胞膜破坏,从而导致细胞死亡。细菌素Lac-B23能够破坏荧光假单胞菌生物膜中的网络结构,对生物膜具有明显的破坏作用。     

富马酸钠对荧光假单胞菌群体感应现象及其腐败活性的抑制作用

以报告菌株紫色杆菌CV026为检测模型,探究富马酸钠对荧光假单胞菌群体感应现象及其腐败特性的影响。采用酶标法及光学显微镜观察富马酸钠对荧光假单胞菌生物被膜的抑制效果,利用气相色谱-质谱分析富马酸钠对荧光假单胞菌分泌信号分子的影响。结果表明：在亚抑菌浓度下,富马酸钠可以显著降低紫色杆菌CV026紫色菌素的产生量（P＜0.05）;当质量浓度为2.0 mg/mL时,富马酸钠对紫色菌素的抑制率达50.95%,且不影响CV026菌株的生长。富马酸钠能有效抑制荧光假单胞菌生物被膜形成、群集与泳动、胞外蛋白酶活性等相关腐败特性,且质量浓度与其抑制作用呈正相关。另外,由气相色谱-质谱检测结果可知,富马酸钠对荧光假单胞菌N-酰基高丝氨酸内酯信号分子的分泌有较好的抑制效果。因此,富马酸钠具有较好的群体感应抑制活性,可作为新型群体感应抑制剂用于水产品贮藏保鲜。     

Biofilm Formation Characteristics of Pseudomonas lundensis Isolated from Meat

Biofilms formations of spoilage and pathogenic bacteria on food or food contact surfaces have attracted increasing attention. These events may lead to a higher risk of food spoilage and foodborne disease transmission. While Pseudomonas lundensis is one of the most important bacteria that cause spoilage in chilled meat, its capability for biofilm formation has been seldom reported. Here, we investigated biofilm formation characteristics of P. lundensis mainly by using crystal violet staining, and confocal laser scanning microscopy (CLSM). The swarming and swimming motility, biofilm formation in different temperatures (30, 10, and 4 °C) and the protease activity of the target strain were also assessed. The results showed that P. lundensis showed a typical surface‐associated motility and was quite capable of forming biofilms in different temperatures (30, 10, and 4 °C). The strain began to adhere to the contact surfaces and form biofilms early in the 4 to 6 h. The biofilms began to be formed in massive amounts after 12 h at 30 °C, and the extracellular polysaccharides increased as the biofilm structure developed. Compared with at 30 °C, more biofilms were formed at 4 and 10 °C even by a low bacterial density. The protease activity in the biofilm was significantly correlated with the biofilm formation. Moreover, the protease activity in biofilm was significantly higher than that of the corresponding planktonic cultures after cultured 12 h at 30 °C.     

水产品荧光假单胞菌双组分信号转导系统的序列分析和功能预测

为研究双组分信号转导系统（two-component signal transduction system,TCS）在水产品优势腐败菌荧光假单胞菌生长繁殖和环境适应过程中的作用,利用生物信息学方法对水产品荧光假单胞菌PF08的TCS进行序列分析和功能预测。结果表明：荧光假单胞菌PF08中存在63 个组氨酸激酶、84 个应答调节蛋白、39 个成对TCS、25 个融合组氨酸激酶;该菌株中所有的组氨酸激酶均具有HATPase_c和HisKA结构域,所有应答调节蛋白均具有REC结构域;系统发生树结果表明具有相同结构域的TCS多聚于同一聚簇,其可能具有相近的功能;该菌株39 对TCS有25 对的生物学功能得到预测,其主要参与调控荧光假单胞菌PF08的营养元素代谢、生物体内物质运输、细胞形态分化、应对不利环境及细胞抗性和毒力等。该研究结果为进一步阐明TCS在水产品荧光假单胞菌PF08菌株环境适应过程中的功能提供一定参考。     

腐败希瓦氏菌和荧光假单胞菌对冷藏凡纳滨对虾虾汁品质的影响

为研究腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的致腐败能 力以及两种菌之间的相互关系,将这两种菌株的单一培养物和混合培养物分别接种至无菌虾汁中,于（4±1）℃下 培养8 d,测定虾汁中菌落数及总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen,TVB-N）、氨基酸、腐胺、肌浆蛋白 和挥发性物质含量的变化情况。结果表明：混合接菌组中S. putrefaciens和P. fluorescens的最大菌落数分别为8.85、 8.26（lg（CFU/mL））,均高于单独接菌组。且混合接菌组的TVB-N含量和腐胺含量明显高于两组单一接菌组。 在虾汁培养物中S. putrefaciens比P. fluorescens更容易生长繁殖,这两种菌存在协同作用,可相互促进彼此的生长和 加速凡纳滨对虾虾汁的腐败。     

Bioactive amines changes in raw and sterilised milk inoculated with Pseudomonas fluorescens stored at different temperatures

The presence of bioactive amines in raw and sterilised milk inoculated with Pseudomonas fluorescens during storage at 4°C, 7°C and 10°C for 6 days was investigated. Spermine, spermidine, putrescine, serotonin and phenylethylamine were present in the samples immediately after milking. Histamine, cadaverine and tyramine were formed in the raw milk on the 4th day of storage at 10°C, increasing significantly afterwards. Cadaverine was formed during sterilisation. There was no significant change in amines, acidity, thermostability and alizarol tests throughout storage of the sterilised milk; however, a putrid smell was detected at every temperature on the 6th day. Therefore, raw or sterilised milk storage at 4–7°C should not exceed 4 days. Furthermore, raw milk should not be stored at 10°C.