液质联用法测定水产品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量

目的建立一种高效液相色谱法-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)测定水产品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量的分析方法。方法分析采用Shiseido C_(18)色谱柱(2.0mm×150 mm,5μm),流动相A为乙腈,流动相B为5 mmol/L乙酸铵(pH=4.5),流动相比例A:B=75:25(V:V),等度洗脱。流速:0.2mL/min,柱温:35℃,采用电喷雾离子源正离子扫描(electron spray ionization,ESI~+),多反应监测模式对样品进行检测(multiple reaction monitoring,MRM)。结果孔雀石绿在1.152～23.04 ng/mL浓度范围内线性良好,相关系数r为0.999;隐色孔雀石绿在1.216～24.32 ng/mL浓度范围内线性良好,相关系数r为0.999。本方法回收率范围在89.1%～105.7%,精密度在2.9%～3.9%。检出限为0.2μg/kg。结论该方法前处理简单快捷,灵敏度高,检测成本降低,结果准确可靠,可适用于水产品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿的测定。     

高效液相色谱串联质谱法测定水产品中的孔雀石绿和结晶紫

目的建立高效液相色谱串联质谱法检测水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫残留量的方法。方法待检水产品经乙腈提取,中性氧化铝固相萃取柱净化, 0.22μm微孔滤膜过滤后用高效液相色谱串联质谱进行检测。结果 4种化合物在0～100.0ng/mL浓度范围内线性关系良好,相关系数大于0.999,检出限均可达到0.25μg/kg,回收率为85%～110%,相对标准偏差均小于10%。结论本方法使用试剂少、步骤简单,适用于大批量水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的检测。     

免疫金银染色法快速检测水产品中孔雀石绿残留的研究

目的研究一种快速、稳定地检测水产中孔雀石绿残留的方法。方法基于胶体金免疫层析技术,采用竞争法,以硝酸纤维素(nitrocellulose,NC)膜为载体,以孔雀石绿单克隆抗体为标记蛋白,制备一种金标免疫层析试纸条用于渔药残留快速检测,同时用免疫金银染色法提高试纸条的灵敏度。结果该检测系统选用20nm直径的胶体金用于标记抗体,最适p H为9.0,最适蛋白结合量为每1 m L胶体金结合15μg抗体蛋白。标记成功的抗体以1:10比例稀释并取20μL固定到用PBS(0.01 mol/L,10%蔗糖,0.05%吐温-20)预处理过的玻纤膜上,作为金标垫。用于包被NC膜的抗原与二抗浓度分别为3 mg/m L和0.7 mg/m L。用免疫金银染色法放大显色信号,制备的试纸条检出限为0.2 ng/m L,并应用到实际鱼样的检测中。整个测试时间约为10 min。结论本方法重现性良好,且置于室温环境下保存90 d后仍稳定可靠,为水产品中孔雀石绿残留的快速检测提供了一条可行途径。     

优化高效液相色谱-串联质谱法检测水产品中 孔雀石绿及隐色孔雀石绿的残留量

目的对GB/T 19857-2005中检测水产品中孔雀石绿及隐色孔雀石绿残留量的高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)进行优化。方法经匀质的水产品样品,加20 mL乙腈和5 g酸性氧化铝旋涡振荡,取4 mL提取液,35℃水浴氮吹近干,用7:3(V:V)乙酸铵和乙腈混合溶液1 mL定容,过0.22μm滤膜。样液用HPLC-MS/MS进行检测,以氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿为内标物进行定量。结果本实验的线性范围在0.5~10.0μg/kg,相关系数为0.9994和0.9995,孔雀石绿和隐色孔雀石绿的平均检出限达到0.0241μg/kg和0.0475μg/kg,方法的回收率在91.1%~107.3%之间,相对标准偏差在1.0%~10.4%之间。结论该方法灵敏度高,准确性好,与GB/T 19857-2005相比,简化了前处理步骤,回收率稳定。通过验证,该方法适用于开展水产品中孔雀石绿及隐色孔雀石绿残留的检测。     

孔雀石绿单克隆抗体的制备及鉴定

以合成的孔雀石绿- 牛血清白蛋白(MG-BSA)为免疫原免疫Balb/c 小鼠,利用杂交瘤细胞技术,建立1 株稳定分泌孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞5G6,其分泌的抗体亚类为IgG1,轻链为κ型。间接ELISA 测定腹水效价达1.28 × 105。间接竞争ELISA(ciELISA)显示其对孔雀石绿的50% 抑制浓度(IC50)为1.36ng/ml,除结晶紫(CV)外,与无色孔雀石绿(LMG)没有交叉反应。     

液相色谱紫外／荧光检测法测定水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿

试验旨在建立一种检测水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的液相色谱-紫外/荧光检测方法,并对样品前处理方法进行简化。在乙腈作为溶剂提取步骤中同时加入酸性氧化铝吸附,提取液离心分离后采用串联的丙磺酸阳离子固相萃取柱(PRS)和酸性氧化铝柱净化,0.05 mol/L的乙酸铵/乙腈(20∶80,V/V)为流动相,采用液相色谱-紫外/荧光检测法同时分析孔雀石绿和隐性孔雀石绿的含量,外标法定量。结果表明:孔雀石绿和隐性孔雀石绿在0.05~1.0 mg/L范围内线性良好,相关系数分别为为0.9999和0.9996,最低检出限分别为0.002 mg/L和0.5μg/L。当加标量分别为10、25、50μg时,空白鱼样的加标回收率在72.0%~91.4%之间,RSD均小于7.5%。该方法准确度高,适于水产品中孔雀石绿及其代谢残留产物—隐性孔雀石绿的分析检测。     

养殖水中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、 隐色结晶紫、亚甲基蓝残留量的测定

目的建立一种高效液相色谱-串联质谱同时测定养殖水体中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物和亚甲基蓝残留量的方法。方法将水样用盐酸羟胺-对甲苯磺酸溶液和乙腈提取,二氯甲烷萃取2次后浓缩,用1 mL乙腈-5 mmol/L乙酸铵(1:1,V:V)定容。以乙腈-5 mmol/L乙酸铵(85:15,V:V)混合溶液为流动相进行色谱分离,然后进入串联质谱仪,选用电喷雾离子源,在正离子、多反应监测扫描模式下进行定性,孔雀石绿和结晶紫通过内标法定量,亚甲基蓝通过外标法定量。结果在优化条件下,孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫在0.025~0.600 ng/mL浓度范围内,亚甲基蓝在0.05~1 ng/mL浓度范围内均满足线性关系,相关系数r0.99,方法检出限为0.2 ng/mL。加标浓度在0.2~2.0 ng/mL时,孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫和亚甲基蓝的平均回收率均在70%~110%之间,相对标准偏差均在10%以内。结论该方法简单快速、灵敏度高、前处理成本低、重现性好、回收率高,适用于同时检测养殖水体中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亚甲基蓝残留量。     

孔雀石绿多克隆抗体的制备与筛选

设计并成功合成了三种孔雀石绿半抗原,所有半抗原均采用活化酯法分别与血匙兰蛋白(KLH)偶联制备成免疫抗原,与卵清蛋白(OVA)偶联制备成包被抗原。利用所制备的三种免疫原免疫新西兰大耳白兔都获得了高效价的抗孔雀石绿抗体,并将每一种抗体都与三种包被抗原进行组合配对,通过间接竞争酶联免疫吸附检测(ELISA)方法筛选出最佳的抗体-包被抗原组合,筛选出的抗体采用Sepharose FF-Protein A亲和层析柱纯化,采用间接ELISA法测定效价及鉴定特异性。经测定筛选出的抗体效价达到1:12000,IC50值为0.65 ng/mL,交叉反应表明该抗体有较好的特异性,与结构类似物结晶紫的交叉反应率为18.73%,与隐性孔雀石绿及隐性结晶紫的交叉反应率低于10%。本研究为建立快速检测食品中孔雀石绿残留的免疫分析方法奠定了基础。     

一种高效检测水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法

提供了一种高效检测水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法。待检水产品以目标化合物相应的同位素为内标,经乙腈提取,中性氧化铝柱净化,孔径0.22μm微孔滤膜过滤后用高效液相色谱质谱联用仪检测。结果表明,对不同水产品进行结果验证,4种待测物(孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫)的回收率为85%~120%,检出限均可达到0.5μg/kg,标准曲线相关系数0.999以上。与现有检测方法相比,该方法使用试剂少、步骤简单,适用于水产品中孔雀石绿和结晶紫的大批量检测。     

孔雀石绿人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

通过研究孔雀石绿(MG)抗原的合成和多克隆抗体的制备,探索研究食品中孔雀石绿残留的检测方法。本实验先合成含有羧基的孔雀石绿半抗原(CMG),并用液-质联用法进行分析鉴定。半抗原经重氮化法处理后分别偶联两种载体蛋白BSA和OVA,并通过紫外分光光度法进行鉴定。与CMG标准品和两种载体蛋白的紫外吸收光谱相比,偶联物的吸收峰发生了明显的偏移,计算得免疫原的偶联比为10.6:1,说明偶联成功。通过免疫制备多克隆抗体,并通过间接ELISA法对CMG抗血清的效价进行检测,并进一步检测抗体的特异性,两只兔子的IC50值分别为8.1ng/mL和4.6ng/mL。     

Development of a sensitive and group‐specific polyclonal antibody‐based enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of malachite green and leucomalachite green in water and fish samples

BACKGROUND: Malachite green (MG) is widely used in fishery, since it is easily adsorbed by fish during waterborne exposure and is rapidly metabolised into leucomalachite green (LMG). However, both MG and LMG are potential carcinogens, teratogens and mutagens. In this study the LMG derivative bearing an amino group on the phenyl ring was synthesised and coupled to carrier proteins. An LMG polyclonal antibody‐based enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) was developed and characterised. RESULTS: The ELISA standard curve was constructed with concentrations of 0.1–100 ng mL^?1. The IC₅₀ value for nine standard curves was in the range 0.9–2.6 ng mL^?1 and the limit of detection at a signal‐to‐noise ratio of 3 was 0.02–0.10 ng mL^?1. The cross‐reactivity values of the LMG antibody with MG, crystal violet and leucocrystal violet were 95.25, 29.07 and 212.38% respectively, while less than 0.2% cross‐reactivity was found with eight other compounds. For LMG‐spiked water and fish samples, recoveries were 76.2–95.0% and the correlation coefficient of ELISA with high‐performance liquid chromatography (HPLC) was 0.9752 (n = 7). For (LMG + MG)‐spiked fish samples the results of ELISA were similar to those of HPLC. CONCLUSION: The proposed ELISA can be utilised as an analytical tool for detecting the sum of MG and LMG in water and fish muscle samples. Copyright © 2009 Society of Chemical Industry     

基于广谱性单克隆抗体免疫分析有机磷农药残留

目的制备和筛选出一种能识别一类或几类具有结构相似的有机磷杀虫剂的广谱性鼠单克隆抗体(m Ab)以对多农药残留同时进行检测。方法制备抗有机磷组特异性单克隆抗体,利用间接竞争性ELISA法对几种有机磷农药的标准品进行检测。结果对乙基毒死蜱检测灵敏度较高,最低检测限(LOD)为4 ng/m L,对甲基对硫磷的LOD为63 ng/m L;辛硫磷和三唑磷的检测敏感度低、一致性差。结论根据农药化学结构的不同,检测灵敏度有一定的差别,对乙基毒死蜱和甲基对硫磷检测效果较好。     

隐性孔雀石绿多克隆抗体的制备及鉴定

研究制备孔雀石绿(MG)代谢物隐性孔雀石绿(LMG)多克隆抗体进而间接鉴定鱼体中孔雀石绿的残留。首先利用化学方法合成含羧基的隐性孔雀石绿衍生物(CLMG),然后采用碳化二亚胺法偶联牛血清白蛋白(BSA)合成免疫抗原隐性孔雀石绿-BSA,按照常规免疫程序免疫新西兰大白兔制备抗隐性孔雀石绿多克隆抗体。采用间接酶联免疫吸附实验(iELISA)测定抗血清中抗隐性孔雀石绿多克隆抗体效价。结果表明：抗隐性孔雀石绿的抗体效价为1: 32000,可用于隐性孔雀石绿的免疫学检测。     

异丙威单克隆抗体的制备及鉴定

异丙威是我国农业生产中常见的杀虫剂,在果蔬、粮食和烟草等中都有广泛应用,然而这类农药也具有较强生物毒性。为了制备异丙威单克隆抗体,以实现对农药异丙威药物的快速检测。本文以2-异丙基苯酚等为原料,合成异丙威半抗原及人工抗原,并通过免疫小鼠、细胞融合、克隆、筛选获得单克隆抗体细胞株,经腹水诱导法及辛酸-硫酸铵沉淀法制得异丙威单克隆抗体,通过间接竞争ELISA法对抗体的特异性进行鉴定。结果表明,制备的异丙威单克隆抗体检测范围为1.88~82.80 ng/m L,抗体的IC50为11.70ng/m L,最低检测限为0.54 ng/m L,抗体与克百威、西维因、涕灭威、灭多威、2-异丙基苯酚5种异丙威结构类似物均无明显交叉反应,具有高特异性,能够满足农产品中异丙威残留检测的要求。异丙威单克隆抗体的制备为异丙威快速检测产品的开发奠定了基础。     

基于单克隆抗体的双酚A半抗原直接包被的酶联免疫吸附法的建立

传统的人工抗原包被酶联免疫吸附法(ELISA)依赖疏水相互作用将人工抗原与酶标板结合,会影响半抗原的呈现与识别,且多采用多克隆抗体为检测抗体,这些均会导致检测灵敏度下降和标准化难度增大。该研究选择双酚酸(BVA)作为双酚A(BPA)的半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原免疫BALB/c小鼠,获得一株可分泌BPA单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。利用3-氨丙基三乙氧基硅烷硅化处理酶标板,将BVA直接包被在酶标板上,建立了一种基于MAb的半抗原直接包被的BPA间接竞争ELISA法。该检测方法最低检测限IC10为0.29 ng/mL,半数抑制率IC50为5.4 ng/mL,水样中加标回收率为94.04%~102.31%。与人工抗原包被BPA ELISA检测方法(IC10:0.5 ng/mL,IC50:16.65 ng/mL,水样中加标回收率为89.72%~105.25%)相比,检测灵敏度显著性提高。     

苏丹红Ⅰ单克隆抗体的制备及其间接竞争ELISA 检测

重氮法合成苏丹红Ⅰ的结构类似物,通过活性酯法将苏丹红Ⅰ的结构类似物偶联到载体蛋白上制备人工抗原,用所制备的人工抗原免疫BALB/c 小鼠,采用细胞融合的方法制备苏丹红Ⅰ单克隆抗体,结果成功筛选到一株抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体,经鉴定为IgG2a 型,并建立间接竞争ELISA 检测方法,线性范围为0.5～10ng/mL,检测下限为0.1ng/mL,加标回收率为52.3%～110%,变异系数为3.2%～8.9%。     

羧基隐性孔雀石绿半抗原及全抗原的合成鉴定

以4-羧基苯甲醛,N,N-二甲基苯胺为原料合成羧基化隐性孔雀石绿(COOH-LMG),经薄层色谱、红外光谱、紫外光谱、液质联用仪鉴定该羧基化隐性孔雀石绿为目标产物。羧基隐性孔雀石绿经碳二亚胺法与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)载体蛋白相结合,分别得到免疫原与包被原。通过紫外分光光度计鉴定,人工抗原偶联物的吸收峰较反应前的反应物的吸收峰发生了漂移,证明耦合成功。新西兰大白兔经免疫原5次免疫后,得到针对隐性孔雀石绿的抗体,效价达1∶64000,为LMG的单抗的制备及其免疫学分析方法提供了重要依据。     

基于单链抗体的呋喃唑酮酶联免疫检测方法的建立

目的:为快速检测呋喃唑酮(furazolidone,FZD)在动物性食品中的残留量。方法:基于单链抗体的间接竞争酶联免疫吸附实验法建立了FZD检测方法。结果:最佳抗原工作质量浓度为2μg/m L,最佳抗体稀释倍数为1∶500,一抗最佳反应时间为60 min,二抗最佳反应时间为45 min,四甲基联苯胺最佳显色时间为20 min。FZD检测试剂盒在10~100 ng/m L范围具有较好的线性关系,IC50值为13.01 ng/m L,检出限为1.28 ng/m L,回收率为73.38%~84.52%。结论:与抗FZD单克隆抗体相比,所建立的检测试剂盒检测范围更广,且具有很高的灵敏度以及很好的特异性和稳定性。