一株产聚乙烯醇降解酶的紫色杆菌的发酵条件研究

从聚乙烯醇(PVA)污染环境中筛选出一株产聚乙烯醇降解酶活力较高的菌株WSH04-01,该菌株能够利用聚乙烯醇作为唯一碳源进行生长.通过一系列生理生化试验和16S rDNA序列分析结果,鉴定该菌株属于紫色杆菌属(Janthinobacterium sp.),实验室编号WSH04-01.这是目前国内外有关紫色杆菌产生PVA降解酶的首例报道.首先对菌株合成PVA降解酶的营养条件进行了考察,通过单因素试验和正交试验确定了菌株最优培养条件为PVA10 g·L-1,葡萄糖3 g·L-1,酵母膏6 g·L-1,K2HPO4 2 g·L-1,KH2PO4 0 25 g·L-1,MgSO4 0.05 g·L-1,CaCl2 0.05 g·L-1,FeSO4·7H2O0.02 g·L-1,NaCl 0.02 g·L-1.最适发酵温度为30℃,培养基初始pH为7.2,装液量为30 mL培养基(250mL摇瓶)-1,接种量为8%.在最优条件下,PVA降解酶酶活可以达到4.94 U·mL-1,略高于正交试验中的最高酶活(4.83 U·mL-1).同时利用凝胶渗透色谱得到分子量分布图,对最优发酵条件下发酵过程中聚乙烯醇的降解进行了验证.     

细菌产β-葡萄糖苷酶发酵优化

从栀子果中分离到一株在较高温度下产β-葡萄糖苷酶的地衣芽孢杆菌,对其产酶条件进行了优化.通过单因素实验和正交实验确定该菌株产酶的最佳培养条件为:碳源(甘蔗渣粉∶麸皮=3∶1)5%,牛肉膏 0.5%,栀子甙 0.2%,KH2PO4 0.4%,MnSO4 0.04%,pH值9.0,装液量20 mL/250 mL,种子液接种量10%,45℃发酵24 h.优化条件下发酵液中的酶活可达到93.48 U·mL-1.     

原油降解菌的筛选及降油率比较

经牛肉膏蛋白胨液体培养基驯化、固体培养基分离纯化,从长庆油田措施废液集中处理后残渣中筛选出了5株具有较强降解石油能力的微生物菌株,将其分别编号为D1、D2、D3、D4、D5。通过形态学和生理生化实验对分离得到的纯种菌株进行鉴定,结果表明D1属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.),D2属于链球菌属(Streptococcus sp.),D3属于黄杆菌属(Flavobacterium Bergey sp.),D4属于微球菌属(Micrococcus Cohn sp.),D5属于产碱菌属(Alcaligenes sp.)。将得到的5株纯菌株在牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养3 d,分别按单株菌株5 mL、2种菌株以1:1的比例各5 mL、3种菌株以1:1:1的比例各5 mL的接种量,分别接种到原油液体培养基中培养,7 d后,按照《CJ/T 57-1999》标准测定原油降解率。比较原油降油率,得到2种菌株组合接种的降油率高于3种菌株组合高于单菌菌株。其中D1、D4按照1:1比例,各5 mL的接种量接种到原油液体培养基中得到的降油率最高,为89.39%。     

产壳聚糖酶菌株的筛选及其发酵产酶条件的研究

从采集的土样中分离得到一株产壳聚糖酶的菌株,对该菌株发酵产酶条件进行了初步研究.确定其最适的产酶培养基为(%):壳聚糖1.0,葡萄糖0.1,酵母提取物0.5,(NH4)2SO4 1.0,K2HPO4 0.07,KH2PO4 0.03,NaCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.05,起始pH值6.0;最适产酶培养条件为:装液量为70 mL/250 mL,接种量3%,30℃、150 r·min-1培养72 h.在最适产酶条件下,该菌株发酵液中壳聚糖酶活力最高达到1.96 U·mL-1.     

2,2-二甲基环丙腈水合酶产生菌的氮离子注入选育及突变株产酶条件研究

离子注入技术被广泛应用于微生物的品种改良.利用N 离子注入法对本实验室筛选并保藏的产2,2-二甲基环丙腈水合酶菌种Pseudomonas sp.ZJUT0509进行选育,以提高2,2-二甲基环丙甲酰胺的产量,为进一步的手性拆分提供更多的原料.结果表明,氮离子注入诱变Pseudomonas sp.ZJUT0509的存活率曲线符合离子注入诱变的"马鞍型"特征曲线.通过离子注入获得的突变株的腈水合酶活性有显著提高,其中突变株F60-4的酶活达30.1 U·mL-1,约为原始菌株的9倍.对突变株F60-4进行产酶条件的优化考察,获得了培养条件.F60-4菌株产酶的最佳碳源是葡萄糖(2 g·L-1),最佳氮源是酵母粉(10 g·L-1),最适初始pH值为6.5,最适发酵温度为20℃,最佳诱导剂为1.0g·L-1的己内酰胺.与原始菌株Pseudomonas sp.ZJUT0509相比,突变株F60-4对有机氮源的利用率更高.最佳诱导剂由己内酰胺代替了原来的2,2-二甲基环丙甲腈,使实验操作简便.突变株F60-4的发酵周期为36 h,比原始菌株缩短了12 h.     

纳豆菌的分离筛选与鉴定

采用酪蛋白平板初筛,从日本北海道生产的纳豆食品中筛选出5株产纳豆激酶的菌株,分别编号XD1~5;再采用纤维蛋白平板复筛,通过比较透明圈大小筛选得到高产纳豆激酶菌株XD2,并通过16SrDNA基因序列对其进行鉴定。结果表明,5株菌株均能产纳豆激酶并能分解纤维蛋白,其中,菌株XD2所产纳豆激酶的酶活最高,为989.3U·mL~(-1);16SrDNA基因序列鉴定菌株XD2为枯草芽胞杆菌。     

β-葡萄糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆与表达

利用栀子苷培养基从滨海新区盐碱地土样中筛选得到一株高产β-葡萄糖苷酶菌株,酶活力达到14.82U·mL-1,经16SrDNA鉴定,命名为短小芽孢杆菌B-4。克隆获得B-4β-葡萄糖苷酶基因,测序结果表明,其大小为1437bp,与GenBank中短小芽孢杆菌SAFR-032β-葡萄糖苷酶基因YP_001488769.1序列比对,核苷酸序列同源性达97%,氨基酸序列同源性达99%。进一步利用表达载体pET-22b（＋）,实现β-葡萄糖苷酶基因bglB在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达,酶活力达46.85U·mL-1。     

粗糙脉孢菌固态发酵产纤维素酶工艺优化

从青储饲料中分离得到一株产纤维素酶能力较强的丝状真菌,经形态学和26SrDNA D1/D2区序列比对分析,确认该菌株属粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。通过单因素实验和正交实验探讨了碳源、氮源、无机盐、料水比、培养温度、培养时间对菌株固态发酵产纤维素酶的影响。确定最适产酶工艺为:碳源麸皮与稻草秆的质量比6∶4、氮源3%(NH4)2SO4、料水比1∶1.5(g∶mL)、培养温度30℃、培养时间60h,无机盐KH_2PO_4和MgSO_4对产酶影响不显著,在最适产酶工艺下,固态发酵产纤维素酶酶活达到251.27U·g-1以上。     

人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母中的高效表达

去除自行构建的质粒pPIC9K-07ALDH2的信号肽(α-Factor)得到质粒pPIC9K-ALDH2-delsign,采用电转化方法将该质粒转化到Pichia pastorisSMD1168中构建得到能在胞内高效表达人乙醛脱氢酶2(ALDH2)的基因工程菌株Pichia pastorisSMD1168(pPIC9K-ALDH2-delsign)。利用该重组毕赤酵母摇瓶发酵得到的发酵液的人ALDH2的酶活为0.315 U.mL-1,明显高于胞外表达时人ALDH2的酶活;经过亲和色谱分离纯化后的人ALDH2酶液的酶活为0.944 U.mL-1。     

产纤维素酶放线菌的筛选鉴定及其对玉米秸秆的降解

从寒地黑土中筛选得到一株对纤维素具有降解能力的菌株,观察该菌株的形态特征并对其进行分子生物学鉴定。采用响应曲面法对该菌株降解玉米秸秆的条件进行优化,并对玉米秸秆降解前后的结构变化、主要成分变化进行观察和测定。结果表明:该菌编号为GS-4-21,其透明圈与菌落直径的比值(D/d)为5.54±0.20,滤纸酶活、纤维素外切酶活、纤维素内切酶活和β-糖苷酶酶活分别为11.94±0.51、12.07±0.43、32.94±0.83和30.87±1.04 U/mL。经鉴定菌株GS-4-21属于链霉菌属。当以体积分数3%接种至pH为6的发酵培养基中,28℃、160 r/min发酵5 d时,玉米秸秆的降解率可达23.54%。SEM结果表明:菌株GS-4-21具有较好的纤维素降解能力。玉米秸秆中纤维素、半纤维素、木质素的降解率分别为30.33%、31.95%、18.91%。