核心蛋白聚糖在毕赤酵母中的表达及活性检测

目的利用巴氏毕赤酵母真核表达系统表达人核心蛋白聚糖DCN,并检测其抗肿瘤活性。方法利用DCN的特异引物,通过RT-PCR扩增人DCN基因,与载体pPIC9K连接,将序列正确的重组体扩增后,酶切线性化,通过醋酸锂法转化酵母菌HIS-/GS115,G418筛选阳性克隆,用含1%甲醇的BMMY培养基诱导表达,并观察纯化的表达产物对人肝母细胞瘤细胞(HepG2)增殖的影响。结果表达产物作用于HepG2细胞后,与对照组相比,细胞增殖数量及速度均显著降低。随着表达产物浓度的升高及作用时间的延长,抑制作用也增强,并表现出浓度和时间依赖性关系。细胞形态学观察表明DCN对HepG2生长有明显抑制作用。结论已成功构建了pPIC9K-DCN真核表达载体,并表达了有活性的蛋白产物。     

重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin在毕赤酵母中的表达及其活性

目的利用毕赤酵母表达系统表达BoNT-LH(N)-Elafin融合蛋白,并检测其生物学活性。方法构建pPIC9K-BoNT-LH(N)-Elafin重组真核表达质粒,转化毕赤酵母GS115菌株,甲醇诱导表达,取上清,经阳离子交换层析纯化融合蛋白,并检测其反应原性、抗弹性蛋白酶活性及对SNARE蛋白复合体的裂解作用。结果重组表达质粒pPIC9K-BoNT-LH(N)-Elafin经双酶切及测序证实构建正确;表达的BoNT-LH(N)-Elafin融合蛋白相对分子质量约为110 000,纯化的融合蛋白纯度达92%,浓度为54 mg/L,反应原性良好,具有抗弹性蛋白酶活性及裂解SNARE蛋白复合体的作用。结论已在毕赤酵母GS115中成功表达了重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin,该融合蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究其抑制气道黏液高分泌的机制奠定了基础。     

人甲状旁腺素在甲醇毕赤酵母中的分泌表达

选用酵母偏爱的密码子,人工合成长度为282bp的人甲状旁腺素(hPTH)基因,将其克隆于M13载体中,DNA测序验证正确。通过PCR从含有hPTH基因的M13载体获得了该基因,将其插入到含有AOX1启动子和α因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中,构建了重组质粒pPIC9K-hPTH,电击法转化甲醇毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株,经G418筛选得到高拷贝转化子,甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明在9 3kDa处有明显的诱导蛋白带,与报道的hPTH的相对分子质量相近;酶联免疫沉淀法(ELISA)检测证明表达的蛋白具有hPTH免疫活性为132ng/L。     

重组免疫毒素IL-6_(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中自诱导表达条件的优化

目的优化重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,以提高菌体浓度及可溶性目的蛋白的表达量。方法采用摇瓶培养,利用单因素和正交试验对工程菌自诱导的培养条件(接种量、诱导时间、诱导温度、装瓶量)和培养基组分(有机氮源、无机氮源、碳源、有机酸)进行优化,检测菌体浓度、可溶性目的蛋白的表达量及质粒稳定性。结果确定最适自诱导培养条件为装瓶量20 ml/250 ml、接种量2%,28℃诱导25 h;最适自诱导培养基组分为:蛋白胨2%、酵母浸粉0.5%、Na2HPO425 mmol/L、KH2PO425 mmol/L、硫酸铵25 mmol/L、葡萄糖0.05%、甘露醇1%、乳糖0.6%、苹果酸钠20 mmol/L、MgSO40.5 mmol/L。此时可溶性目的蛋白的表达量和菌体浓度分别为LB培养基(IPTG诱导)的1.76和2.12倍,质粒稳定性由87%提高至98%。结论优化了重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,为其工业化生产奠定了基础,也为自诱导在其他重组蛋白药物生产中的应用提供了参考。     

抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Cecropin D,并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0.5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM-Sepharose层析柱纯化,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果经Tricine-SDS-PAGE检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽Cecropin D对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论抗菌肽Cecropin D成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。     

人纤溶酶原K5基因在毕赤酵母中的表达及其抗肿瘤活性

目的在毕赤酵母中表达人纤溶酶原K5基因,并检测hK5蛋白的抗肿瘤活性。方法根据酵母遗传密码的偏爱性优化设计hK5基因,构建重组表达质粒p819-8α-hK5,经G418加压筛选和甲醇诱导表达,并对摇瓶发酵条件进行优化。表达的hK5蛋白经纯化后,通过荷H22肿瘤昆明小鼠模型检测其抗肿瘤活性。结果筛选到2株高表达hK5蛋白的转化子,摇瓶表达量超过150mg/L,纯化后的蛋白纯度大于95.0%,并能够显著抑制昆明小鼠H22肿瘤的生长。结论hK5基因能够在毕赤酵母中高效分泌表达,且表达的hK5蛋白具有良好的抗肿瘤活性。     

一种新型杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

目的在毕赤酵母中表达杂合抗菌肽CA(1-11)CD(12-37)ME(1-18)(ADM),并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母(Pichia pastoris)偏爱密码子,合成杂合抗菌肽CA(1-11)CD(12-37)ME(1-18)基因,插入pPIC9K载体,构建重组表达质粒pPIC9K-ADM,电转化至毕赤酵母GS115,筛选阳性菌株,甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE检测ADM蛋白的表达,并对其抗菌活性进行初步检测。结果重组表达质粒pPIC9K-ADM经双酶切和测序鉴定证明构建正确;阳性酵母转化子的PCR产物可见目的基因条带;杂合抗菌肽在毕赤酵母GS115中获得分泌表达,可溶性蛋白约占菌体总蛋白的13%;且对E.coli DH5α、E.coliJM109和金黄葡萄球菌具有一定的抗菌活性。结论已在毕赤酵母GS115中表达了具有一定抗菌活性的杂合抗菌肽ADM,为相关新药的研究奠定了基础。     

重组猪源抗菌肽Cecropin P1在毕赤酵母中的分泌表达与活性研究

为构建活性表达重组猪源抗菌肽Cecropin P1的酵母基因工程菌,采用重叠区基因扩增拼接法设计并合成其编码基因,分别载入分泌型表达载体pPICZαB和pGAPZαA中,酶切线性化后电穿孔导入酵母细胞进行整合,经高拷贝整合子筛选以及表型筛选获得高效表达抗菌肽的重组菌株,经培养条件优化确定摇瓶发酵抗菌肽的最佳收获时间,据...     

人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母中的高效表达

去除自行构建的质粒pPIC9K-07ALDH2的信号肽(α-Factor)得到质粒pPIC9K-ALDH2-delsign,采用电转化方法将该质粒转化到Pichia pastorisSMD1168中构建得到能在胞内高效表达人乙醛脱氢酶2(ALDH2)的基因工程菌株Pichia pastorisSMD1168(pPIC9K-ALDH2-delsign)。利用该重组毕赤酵母摇瓶发酵得到的发酵液的人ALDH2的酶活为0.315 U.mL-1,明显高于胞外表达时人ALDH2的酶活;经过亲和色谱分离纯化后的人ALDH2酶液的酶活为0.944 U.mL-1。     

黑曲霉脂肪酶全基因合成及其在毕赤酵母中的表达

黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶,在食品、制药、前体化合物的合成和手性化合物的拆分等方面有广泛的用途。获得高效表达黑曲霉脂肪酶的基因工程菌是该酶工业化生产的前提。根据黑曲霉脂肪酶LIP的氨基酸序列及毕赤酵母密码子的偏爱性,设计合成26条相互重叠20 bp的引物,通过组装PCR分别合成lip基因的4个片段lipA1(300bp)l、ipA2(237 bp)l、ipA3(234 bp)和lipA4(210 bp)。再以基因头lip1和基因尾lip26为引物,以lipA1l、ipA2l、ipA3和lipA4混合物为模板进行第二轮PCR扩增,得到的产物经加A处理后,连接到载体pMD18-T上,挑取重组子测序。通过PCR扩增对人工合成的基因进行校正,得到完全正确的lip基因。将优化后的基因克隆到表达载体pPIC9K上,获得的重组质粒pPIC9K-lip经线性化后转化毕赤酵母GS115菌株,构建分泌型表达LIP的酵母工程菌,G418梯度筛选,得到高拷贝稳定整合菌株。为重组黑曲霉脂肪酶的规模化制备奠定了基础。     

重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A在毕赤酵母中的表达及纯化

目的在毕赤酵母中表达Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A。方法提取Thermomonospora fusca基因组DNA作模板,PCR扩增纤维素酶Cel6A基因,克隆到毕赤酵母表达载体pGAPZαA上,用电击法将线性Cel6A-pGAPZαA核酸片段转化毕赤酵母X-33株,克隆PCR鉴定法筛选阳性转化株,培养传代。选择稳定株,培养3d后取培养液上清,用His-BindQuick Cartridge300提取表达的重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A。结果一步His-Bind Quick Cartridge300层析可提取电泳纯的重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A,SDS-PAGE分析显示相对分子质量约为60000,收率为200mg/L,用羧甲基纤维素法测活性为500U/mg,用滤纸法测活性为1U/mg。结论已在毕赤酵母中成功表达了Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A。     

人血管内皮生长因子受体FLT-1胞外区1-3环cDNA的表达、纯化及鉴定

目的　研究人血管内皮生长因子受体FLT 1胞外区 1 3环cDNA在酵母菌中的表达、纯化及生物学活性。方法　将编码 316个氨基酸残基的人FLT 1胞外区 1 3环cDNA插入到含AOX1启动子和d分泌信号肽序列的Pichiapastoris酵母载体中 ,构建了重组表达质粒pPICqk/FLT l(1～ 3) ,转化酵母宿主菌GS115 ,筛选His+ Mut表型转化子 ,经摇瓶培养 ,1%甲醇诱导表达。结果　经SDS -PAGE显示 ,表达产物以可溶性分子形式存在于上清中 ,诱导 4天的表达量达到培养上清总蛋白的 6 0 % ,径Westernblot检测抗原性及特异性良好 ,经CM SepharoseFF阳离子交换层析和Sephacryls 10 0分子筛层析 ,纯度达 90 %以上 ;经生物活性检测具有结合hVEGF16 5的能力和hVEGF16 5促进HUVEC的增殖功能。结论　人血管内皮生长因子受体FLT 1胞外区 1～ 3环cDNA在酵母菌中表达成功。     

人脑钠肽与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其活性

目的在毕赤酵母中表达重组人脑钠肽(BNP)与人血清白蛋白(HSA)融合蛋白,并检测其活性。方法重叠PCR法拼接BNP二联体与HSA基因,插入表达载体pPIC9K,电穿孔法转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定及活性检测。结果融合基因(BNP)2-HSA经测序正确,重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确。诱导72h,融合蛋白表达量最高,可达200mg/ml,且具有良好的反应原性,其活性为rhBNP标准品的1%。结论已在毕赤酵母中成功表达了具有一定生物活性的(BNP)2-HSA融合蛋白,为开发BNP长效药物奠定了基础。     

碱性纤维素酶基因在巴氏毕赤酵母中的表达及重组酵母菌发酵工艺的优化

目的克隆碱性纤维素酶基因,构建酵母整合型表达质粒,在巴氏毕赤酵母中表达,并对重组菌的发酵工艺进行优化。方法应用PCR技术从嗜碱性芽孢杆菌ATCC21833中扩增碱性纤维素酶基因,克隆至酵母整合型表达载体pGAPZαA中,构建重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833,并转化至巴氏毕赤酵母GS115。通过单因素实验及正交实验,确定重组酵母的最佳发酵培养基。在20L发酵罐中进行高密度发酵,观察碳源对批式发酵的影响,并检测在4种流加方式(连续恒速流加、间歇匀速流加、间歇递减流加、维持底物浓度流加)下的菌体干重及发酵液中的酶活性。结果重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833经酶切及DNA测序证明构建正确,其基因序列与嗜碱性芽孢杆菌KSM-635的碱性纤维素酶基因序列一致。最佳发酵培养基组成为6%葡萄糖、2%硫酸铵、12g/L磷酸二氢钾。碳源浓度对于重组酵母菌体生长及产酶至关重要。SDS-PAGE表明表达产物的相对分子质量约为103000。维持底物浓度的流加方式可获得最高的菌体干重(29.8g/L)及酶活力(24U/ml)。结论已成功构建了表达碱性纤维素酶的巴氏毕赤酵母工程菌,并确定了维持底物浓度的流加方式为最佳发酵方式。     

EGF-PE35KDEL重组毒素的基因构建及表达

目的　构建表达有特异细胞毒性融合蛋白的工程质粒。方法　利用PCR扩增出PE3 5KDEL基因片段 ,经酶切后插入EGF PET2 8A载体 ,并转化至BL2 1(DE3 )中。采用Westernblot对重组毒素进行鉴定。结果EGF PE3 5KDEL重组毒素占菌体总蛋白的 2 0 % ,分子量约为 410 0 0。结论　EGF PE3 5KDEL的成功构建和表达为开发靶向抗癌药物奠定了基础     

Pichia酵母表达重组人可溶性TRAIL的纯化与生物活性

目的分离纯化Pichia酵母表达的重组人可溶性TRAIL,并检测其生物活性。方法以Pichia酵母分泌型表达TRAIL,采用硫酸铵沉淀和柱层析纯化可溶性TRAIL蛋白。以SDSPAGE、ESIMS和Westernblot法鉴定其纯度及特异性。以细胞透射电镜、DNALadder和MTT法检测其诱导肿瘤细胞凋亡活性。结果目的蛋白以可溶形式存在,蛋白相对分子质量22000,纯化后纯度95%。Westernblot证实为TRAIL蛋白。电镜、DNALadder和MTT均证实其具有诱导肿瘤细胞凋亡活性。结论Pichia酵母表达rhsTRAIL可用柱层析法纯化,并具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物活性。     

乙酰肝素酶大亚基在毕赤酵母中的表达

目的构建乙酰肝素酶(HPA)大亚基片段真核表达质粒,并在毕赤酵母中表达重组蛋白。方法根据GenBank中登录的HPA大亚基基因序列设计引物,PCR方法扩增肝素酶基因,构建毕赤酵母真核表达质粒pPICZαA-HPA。电击穿孔法转化感受态毕赤酵母SDM1168,斑点免疫印迹法筛选重组菌株,PCR法鉴定阳性克隆。甲醇诱导表达重组蛋白,Western blot鉴定表达产物。结果构建的重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;斑点免疫印迹法筛选出的9个单菌落经PCR扩增,均可见1161bp的目的基因条带;表达产物经Western blot分析,具有良好的反应原性,表达量约为5μg/L。结论已成功构建了HPA大亚基片段真核表达质粒pPICZαA-HPA,并在毕赤酵母SDM1168中分泌表达了HPA大亚基。