添加豆油对赤霉素GA3发酵的影响

研究了在淀粉发酵培养基中添加豆油对藤仓赤霉菌(Gibberella jujikuroi)产赤霉素GA3发酵效价的影响.结果表明在摇瓶发酵水平,发酵60h后补加1.0%豆油,可使赤霉素效价提高约21%;而在发酵60 h和108 h后采用分批添加方式分别添加0.5%豆油,可使赤霉素效价提高约26%.     

PEG-CaCl2介导苏云金杆菌CryIA(b)基因转化哈茨木霉

为构建兼具杀虫防病双重功效的工程菌株,通过PEG-CaCl2介导的原生质体法将来自苏云金芽孢杆菌的Cry Ⅰ A(b)基因导入生防真菌哈茨木霉中.转化频率约为2～3个转化子/μg质粒DNA.Southern blot和RT-PCR检测结果表明,CryⅠ A(b)基因已经整合到哈茨木霉基因组DNA中,并且在转录水平上得到了表达.各转化子都能够稳定遗传.对转化子的抑菌活性和杀虫活性检测结果表明,转化子不但保持了野生菌株的抑菌活性,而且表现出了一定的杀虫效果.转化子Tp1和Tp2对玉米螟幼虫的矫正死亡率分别为75.00%和72.73%.杀虫防病哈茨木霉工程菌株的构建为研究和开发新型微生物农药探索了新的途径.     

PEG-CaCl_2介导苏云金杆菌CryⅠA(b)基因转化哈茨木霉

为构建兼具杀虫防病双重功效的工程菌株,通过PEG-CaC l2介导的原生质体法将来自苏云金芽孢杆菌的CryⅠA(b)基因导入生防真菌哈茨木霉中.转化频率约为2~3个转化子/μg质粒DNA.Southern b lot和RT-PCR检测结果表明,CryⅠA(b)基因已经整合到哈茨木霉基因组DNA中,并且在转录水平上得到了表达.各转化子都能够稳定遗传.对转化子的抑菌活性和杀虫活性检测结果表明,转化子不但保持了野生菌株的抑菌活性,而且表现出了一定的杀虫效果.转化子Tp1和Tp2对玉米螟幼虫的矫正死亡率分别为75.00%和72.73%.杀虫防病哈茨木霉工程菌株的构建为研究和开发新型微生物农药探索了新的途径.     

链霉菌S1-5菌株鉴定及抗菌性能研究

对一株自行筛选的生防链霉菌S1-5进行了种的鉴定、拮抗活性测定以及抗菌性能的研究.通过对菌株的形态特征、培养性状和生理生化特征进行综合试验分析,鉴定该菌株为灰色链霉菌(Streptomyces griseus).采用平板对峙培养法测定S1-5抑菌活性、抑菌谱,结果表明S1-5具有广谱的抗菌活性,对蕃茄叶霉病菌(Fulria fulva)、烟草疫霉菌(Phyto phthora nicotianae)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)以及水稻纹枯病菌(Rhizotonia solani)四种植物病原菌菌丝生长、孢子萌发均具有一定的抑制作用;杀螨试验结果显示S1-5产生物活性物质还对棉花红蜘蛛有一定的杀伤力,是一株值得开发的抗菌杀螨放线菌菌株.     

哈茨木霉几丁质酶基因的cDNA克隆及表达

为了研究全新几丁质酶基因Chit37(DQ647957)的特性与功能,将该基因在大肠杆菌中进行了外源表达.通过构建哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了基因Chit37的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为1032bp,编码343个氨基酸,理论分子量为36.6kDa.采用PCR扩增的方法克隆该基因并将其构建到原核表达载体pET28(a+)上,构建了原核表达载体pET-Chit37并转化宿主菌BL21(DE3),菌落PCR及酶切鉴定均证实转化子的正确性,重组蛋白经IPTG诱导后获得表达.优化的表达条件为终浓度0.1mM IPTG诱导培养4h.     

酿酒酵母原生质体菌株的筛选

实验研究酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae) 原生质体的分离再生及再生菌株的构建 ,以蜗牛酶、纤维素酶、溶壁酶的去壁效果最好 ,而新生酶、几丁质酶的去壁效果较差。 2种以上的酶液混合使用能提高去壁效果。酶解液浓度在 0 .1 %～ 2 %内原生质体释放量随酶解液的浓度升高而上升。酶解液 pH值在 5 .0～ 7.0时原生质体的产量较高 ,渗透压稳定剂以柠檬酸 -磷酸缓冲液( pH6.0 ,内含 0 .8mol/L山梨糖醇 )处理原生质体释放量最高。而培养基对原生质体释放量的影响不明显。通过原生质体融合技术 ,获得融合子HG112 ,对HG112 进行以葡萄糖为基质的发酵试验 ,结果显示该融合子乙醇含量达 7.9% (体积比 ) ,比亲本QT提高 4 9.7% ,该技术可用于筛选优良菌株     

酵母多基因表达载体在纤维素生物转化中应用

构建含酿酒酵母组成型强启动子PGK、G418抗性基因及rDNA片段的整合型载体pScIKP,利用rDNA多个同源重组位点,将外源基因以多拷贝整合到酵母染色体上,无需诱导即可持续表达;利用载体位于表达盒两端同尾酶,可插入多个基因表达盒,实现多基因稳定共表达.为检验共表达情况,反转录从绿色木霉中获得纤维素酶基因eg3和cbh2, 克隆并转化获得重组酵母菌株S.cerevisiae-ec. 该重组酵母能降解羧甲基纤维素形成水解圈;用羧甲基纤维素还原糖法和滤纸酶活力法测定酶活力,其最适温度和最适pH值与所表达单酶相似,表明共表达未影响两种酶的生物学特性;且双酶具有协同作用,能更有效降解非结晶纤维素.pScIKP载体能成功用于多个外源基因共表达和产物协同作用的研究,为构建能直接降解纤维素的酿酒酵母菌株,实现纤维素可再生能源的生物利用奠定了基础.     

米多霉素产生菌原生质体融合研究

从土壤中筛选出的链轮丝菌Streptoverticillium rimofaciens ZD615发酵生产米多霉素的产量较低，但可以通过添加米多霉素的前体提高米多霉素产量；经紫外诱变获得的链轮丝菌Streptoverticillium rimofaciens ZD519产米多霉素的产量相对较高，但丧失了前体利用能力，菌体生长还受前体的抑制.对链轮丝菌ZD615和ZD519原生质体制备最优条件的研究结果表明，甘氨酸质量浓度为0.01 g/mL的菌丝培养基和2 g/L的溶菌酶质量浓度最适于实验菌株原生质体的制备和再生；通过研究紫外灭活ZD615和热灭活ZD519的原生质体的双亲本融合条件,发现当化学融合时间为5 min时，可得到最大的双亲融合率（5.2 ％）.从多种融合子中选育出一株高产链轮丝菌51-19，该菌株能够利用米多霉素的前体物质高产米多霉素，米多霉数产量比出发菌株ZD615提高了170％，达到了1 015 mg/L.     

小麦赤霉病菌FgVPS26与FgRab7的相互作用及对DON毒素合成的影响

小麦赤霉病菌合成DON毒素是多基因控制的次级代谢过程,阐明各种基因的调控作用有利于进行科学防控。以赤霉病菌为研究对象,通过酵母双杂交、实时定量PCR及ELISA等技术研究FgVPS26与FgRab7的相互作用及对DON毒素生物合成的影响。结果表明:FgVPS26和激活态FgRab7可以相互作用,但与原始态FgRab7不能相互合作。FgVPS26和FgRab7基因可相互影响其表达,与野生型菌株PH-1相比,当FgVPS26和FgRab7其中一个基因缺失时另一个基因的表达量将显著下降。另外,FgVPS26或FgRab7基因缺失也显著降低与DON毒素合成相关的Tri基因表达,从而导致同一生长时期突变菌株的DON毒素合成量比野生型菌株PH-1明显减少。因此,小麦赤霉病菌中FgVPS26和FgRab7可以相互作用并调控DON毒素的生物合成。     

柄蓝状菌原生质体的制备与再生条件优化

为了建立以聚乙二醇/氯化钙（PEG/CaCl2）原生质体介导的柄蓝状菌（Talaromyces Stipitatus）高效的遗传转化系统,分别从材料选择,真菌菌龄,不同的渗透压稳定剂,酶的不同种类配比,酶的浓度,酶解时间及不同再生方式对柄蓝状菌EMM原生质的制备与再生条件进行优化。结果表明:以柄蓝状菌EMM 接种生长48 h的菌丝为制备材料,1 mol/L MgSO4作为渗透压稳定剂,菌丝在温度为30 ℃,浓度为50 mg/mL的裂解酶溶液中酶解3 h,得到的原生质体先用再生培养基孵化培养12 h,然后再与PDA培养基混合铺板,以上组合条件下原生质体的释放量可达8.73×108 /mL,再生率可达17.7％。     

抗潮霉素B的水稻原生质体的再生

本实验室构建的具有潮霉素Ｂ（ＨＰＴ）抗性基因、卡那霉素抗性基因（ＫａｎＲ）和虫萤光素酶基因（ＬＣＣ）的质粒ｐＴＨＬ２７ＤＮＡ，用聚乙二醇（ＰＥＧ）法导入到水稻广亲和品种０２４２８的原生质体细胞内．研究原生质体抗性筛选和原生质体再生的条件．结果，在含有２５μｇ／ｍｌ潮霉素Ｂ和１００ｎμｇ／ｍｌ卡那霉素的培养基ＫＰＲ和Ｎ６内连续处理４星期，可以很好地除去非转化的敏感的原生质体再生细胞，然后在无抗菌素选择压力的培养基中，转化细胞可再生成小植株．     

紫外诱变原生质体选育高产L-乳酸菌株的研究

以干酪乳杆菌ZZ-L为出发菌株,对其原生质体制备条件进行了优化.结果表明,用为0.4 mg/mL的溶菌酶溶液和0.7 mol/L NaCl溶液作为渗稳剂对菌龄为22 h的干酪乳杆菌ZZ-L酶解时间110 min,原生质体的形成率为89.5%,再生率为47.7%,达到最佳水平.并对原生质体进行了紫外诱变育种.通过平板和静置发酵实验,筛选得到8株突变株产量比出发菌株高的突变株,其中菌株ZZ-06的L-乳酸产量达78.6 g/L,比出发菌种提高了20.7%,突变株ZZ06经12次传代,其遗传性状稳定.     

里氏木霉Swollenin在毕赤酵母中的表达

通过设计合适的引物,经RT-PCR方法从里氏木霉的总RNA中扩增出Swollenin基因,并将该基因连接到PMD18-T Simple载体,得到该基因的克隆菌株,经酶切并将该基因连接到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαA,得到重组质粒pPICZαA-swo1.将该重组质粒线性化后,通过电转化方法转化毕赤酵母GS115,得到重组菌株P. pastoris-swo1.该菌株的发酵液可使滤纸纤维强度降低,纤维素膨胀及崩解效果明显,表明重构表达的Swollenin可用于木质纤维素的预处理.     

一种耐高温α-淀粉酶高产菌株的选育方法

以一株产耐高温α-淀粉酶菌株（地衣芽孢杆菌）为出发菌株,经过原生质体制备后由NTG（亚硝基胍）药物诱变,从大量突变株中筛选获得一株高产、稳定的耐高温α-淀粉酶产生菌.摇瓶发酵酶活由选育前的2800u/ml提高到了4100u/m左右,提高了近45%.     

利用原生质体融合和诱变育种技术选育高酶活菌株

以白曲霉(Aspergillus kawachii )基因工程菌TR12和黑曲霉(Aspergillus niger)34309为出发菌株，分别用纤维素酶和纤维素酶、溶菌酶的混合酶液制得了两个亲本的原生质体。在研究了培养时间、培养方法、酶解时间、酶解液的配比等条件对原生质体产量影响的基础上，以PDG诱导进行了原生质体的融合，并进行了紫外线照射的诱变育种。通过比较在菌落外观、颜色及形态上与白曲霉和黑曲霉菌株的不同，以及进行分离培养和液态培养摇瓶筛选，获得了一株具有较高酶活力的新菌株，其耐酸性α-淀粉酶活性和糖化酶活性分别达到91．2u／ml和3216．2u／ml的水平。     

反硝化聚磷菌N14原生质体的制备与再生条件研究

以反硝化聚磷菌N14为对象,应用原生质体技术,从菌龄,氨苄青霉素钠预处理的浓度、时间,溶菌酶的浓度、酶解时间和温度等方面研究了该菌原生质体形成和再生的最佳条件。结果表明,反硝化聚磷菌N14原生质体最大制备率产生的条件:在菌龄16 h时加入120μg/m L氨苄青霉素钠预处理6 h,1μg/m L的溶菌酶38℃酶解45 min,再生培养基培养48 h后,该菌原生质体制备率与再生率分别为96.7%和40.9%。溶菌酶酶解时间对菌体再生率的影响大于制备率。     

PEG-CaCl2介导苏云金杆菌QyIA（b）基因转化哈茨木霉

为构建兼具杀虫防病双重功效的工程菌株，通过PEG-CaCl2介导的原生质体法将来自苏云金芽孢杆菌的CryIA（b）基因导入生防真菌哈茨木霉中．转化频率约为2～3个转化子／雌质粒DNA.Southern blot和RT-PCR检测结果表明，CryIA（b）基因已经整合到哈茨木霉基因组DNA中，并且在转录水平上得到了表达．各转化子都能够稳定遗传．对转化子的抑菌活性和杀虫活性检测结果表明，转化子不但保持了野生菌株的抑菌活性，而且表现出了一定的杀虫效果．转化子Tp1和Tp2对玉米螟幼虫的矫正死亡率分别为75．00％和72．75％．杀虫防病哈茨木霉工程菌株的构建为研究和开发新型微生物农药探索了新的诛径．     

纤维素酶EGA基因在枯草芽孢杆菌中的表达及其产物性质研究

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是一种高效的外源蛋白表达菌株,能将目的蛋白分泌到细胞外的培养基中.从福寿螺胃液共生菌株Bacillus sp.Strain AC-1基因组中克隆纤维素酶EGA的基因序列,利用基因工程技术构建纤维素酶EGA的重组枯草芽孢杆菌表达载体pAUsp-ega.该载体含有一个强启动子和一段信号肽,经淀粉诱导能表达外源蛋白.以枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失型菌株WB700为宿主菌,表达得到的重组纤维素酶EGA以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物得到的培养基上清酶活力达到1 120 U/L.该纤维素酶在pH 6.0表现最大水解活力,最适反应温度为60℃,在酸性条件下稳定性良好,具有较好的应用前景.     

哈茨木霉Chiv基因的原核表达及优化

通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化大肠杆菌BL21菌株中,成功地获得了大量的阳性转化子.质粒通过EcoRI和XhoI酶切鉴定及测序鉴定,证明Chiv基因成功地转化到大肠杆菌中.重组大肠杆菌经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现特异的蛋白表达条带,其分子量为50 kDa左右.通过对诱导剂量与诱导时间等因素的优化,结果显示几丁质酶的最佳诱导时间为13 h,最佳诱导剂浓度为1 mM,为几丁质酶的工业化生产奠定基础.     

茂原链霉菌luxR基因对TGase生物合成的作用

前期研究表明,MgCl_2胁迫不但可以提高TGase的产量,还会影响微生物次级代谢产物合成的一个重要调节因子LuxR家族蛋白的表达.为了研究LuxR家族蛋白对茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)TGase生物合成以及菌体生长的调控作用,利用pKC1139为载体,构建luxR基因阻断质粒,通过PEG介导的质粒转化将其转入S.mobaraensis原生质体中,利用单交换同源重组法将整个重组质粒插入到茂原链霉菌基因组中构建S.mobaraensis luxR家族蛋白基因阻断突变菌.利用菌体干重法对比突变菌和野生菌菌体生长变化,利用比色法研究两株菌TGase生物合成的变化,找到LuxR家族蛋白基因表达与TGase生物合成之间的关系.结果发现,本研究采用单交换同源重组的方法可以成功地构建出S.mobaraensis luxR基因阻断突变菌株.通过对比野生菌与阻断菌株生长和TGase活力的变化发现阻断luxR基因会导致菌体生长受阻,TGase合成延迟,并且表达量显著下降.这些研究结果表明本文研究的luxR基因可能是S.mobaraensis合成TGase必不可少的正向调控因子.