黄杆菌肝素酶I基因的克隆与表达

目的克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因。方法通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒pET-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性。结果PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到pET-22b表达载体中。重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS-PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600。结论克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因。     

黄杆菌肝素酶Ⅱ的克隆与表达

目的克隆并表达黄杆菌肝素酶Ⅱ(HepⅡ)的基因。方法通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增出黄杆菌HepⅡ的基因,经验证后插入到表达质粒pET-28a上构建表达载体,重组质粒转化E.coli BL21(DE3)进行蛋白质表达。结果成功地将PCR扩增得到的测序正确的HepⅡ基因构建入pET-28a载体上,重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白,测活显示重组HepⅡ具有活性。结论克隆并成功表达了黄杆菌HepⅡ基因。     

北京棒杆菌高丝氨酸脱氢酶基因的克隆与表达产物活性测定

以北京棒杆菌E31染色体DNA为模板,用PCR法扩增了高丝氨酸脱氢酶(HD)基因。将结构基因装载于pET-28a质粒的T7启动子下游,得到了重组表达质粒pET-HD。将其转入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明,高丝氨酸脱氢酶的活性为不含重组质粒的对照菌的10倍。     

黄杆菌肝素酶Ⅰ基因的克隆与表达

目的 克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因.方法 通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒Pet-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性.结果 PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到Pet-22b表达载体中.重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS.PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600.结论 克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因.     

黄杆菌肝素酶Ⅰ基因的克隆与表达

目的 克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因.方法 通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒Pet-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性.结果 PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到Pet-22b表达载体中.重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS.PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600.结论 克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因.     

噬夏孢欧文氏菌crtY基因在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化

噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)可以累积类胡萝卜素,合成过程涉及的一系列反应都是在相关酶的催化下完成的,其中番茄红素环化酶由基因crtY编码,催化由番茄红素转化为β-胡萝卜素的酶促反应。本研究以噬夏孢欧文氏菌基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应扩增获得crtY基因,测序正确后克隆进表达载体pET-15b,构建表达质粒pET-15b-crtY,重组质粒转化E．coli BL21(DE3),构建工程菌,经IPTG诱导后,重组番茄红素环化酶在大肠杆菌中实现了高效表达,通过镍离子树脂亲和层析和Superdex 75凝胶过滤层析,得到了电泳纯的重组噬夏孢欧文氏菌番茄红素环化酶,该蛋白体外具有催化番茄红素转化为β-胡萝卜素的活性。     

Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403谷氨酸脱羧酶的克隆表达、分离纯化及活性研究

谷氨酸脱羧酶(GAD)是功能因子γ-氨基丁酸(GABA)生物合成过程中的重要酶。为了得到一种有高效活性的GAD基因工程菌,克隆到一种GAD基因,来源于微生物Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403。以pET-22b(+)为载体质粒,Escherichia coli BL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的重组GAD过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白质样品进行SDS-PAGE分析,在约54 000处出现显著的特征蛋白质条带;活性检测结果表明,该重组GAD的转化活性比野生菌株有明显提高,野生菌株经5h细胞转化,反应底物转化率为55.8%,而工程菌20min后转化率达到82.1%,30min后转化可达到98.3%。     

定点饱和突变改善米曲霉木聚糖酶的温度特性

为改善米曲霉木聚糖酶AoXyn11A的温度特性,基于其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,随机替换最高B-factor值位点处的Gly~(21)。以重组表达质粒pET-28a-Aoxyn11A为模板,采用全质粒两步PCR技术对AoXyn11A基因(Aoxyn11A)中编码Gly~(21)的密码子实施饱和突变,将pET-28a-Aoxyn11A各突变体转化E. coli BL21(DE3),构建了突变转化子文库。以酶的热稳定性为指标,从文库中筛选出最优突变转化子(E. coli/Aoxyn11A~(G21I))。DNA测序结果显示,E.coli/Aoxyn11A~(G21I)表达一种由Ile~(21)替换了Gly~(21)的突变酶AoXyn11A~(G21I)。温度特性分析表明:突变酶的最适温度由突变前的55℃提高至65℃;AoXyn11A~(G21I)在55℃及以下稳定,较AoXyn11A提高了7℃。另外,AoXyn11A突变前后的pH特性改变不大。     

对虾抗菌肽PEN-3和PEN-4嵌合基因在大肠杆菌中的表达及抗菌活性测定

目的 表达融合2种具有对虾抗菌肽活性的新型抗菌肽.方法 利用overlap-PCR连接并扩增对虾抗菌肽Penaeidin-3和Penaeidin-4的嵌合基因序列,定向插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建此嵌合基因的表达质粒.将表达质粒转化至E.coli BL21(DE3),经终浓度1.0 mmol/L IPTG分别在37℃和15℃诱导表达4 h和14 h,SDS-PAGE分析嵌合蛋白质的表达,用抑菌圈法测定产物的抑菌活性.结果 获得了含有Penaeidin-3和Penaeidin-4嵌合基因的表达质粒;18%SDS-PAGE电泳显示,大肠杆菌中表达的嵌合蛋白质相对分子质量约14.7×103,主要以包涵体形式存在,包涵体15℃的表达量高于37℃的表达量;包涵体复性后,对枯草杆菌和溶藻弧菌具有明显的抑菌活性.结论 实现了2种对虾抗菌肽嵌合基因在大肠杆菌中的表达.     

分子伴侣共表达对重组蔗糖异构酶异源可溶性表达的影响

蔗糖异构酶(sucrose isomerase,SIase)在异麦芽酮糖的酶法制备中发挥着重要作用。为了提高重组蔗糖异构酶的可溶性表达,作者利用分子伴侣共表达策略将源自Klebsiella sp.LX3的基因SIase进行异源表达并研究了重组酶的酶学性质。利用酶切连接技术构建重组质粒pET-24b-SIase并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行表达,发现其主要表达为包涵体。分别将携带4种分子伴侣蛋白基因的质粒(pKJE7、pGro7、pG-Tf2、pTf16)与含有目的基因的重组质粒在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中共表达,筛选到最佳分子伴侣质粒pGro7且提高了重组SIase的可溶性表达水平,其酶活力为14.8 U/mL,比未进行共表达的工程菌发酵酶活力(3.5 U/mL)有明显提高,进一步利用金属离子螯合层析技术纯化到SIase纯酶,酶学性质研究显示其最适反应温度为40℃,最适反应pH为6.0。动力学常数K_m为(179.10±20.65) mmol/L、k_cat/K_m为(5.44±0.72)...     

密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶基因xylA的克隆及其表达条件的优化

为克隆、表达密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶(GI)基因xylA,并对其诱导表达条件进行初步优化。采用Slowdown PCR方法克隆得到密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)CICIM B0118(A)的葡萄糖异构酶基因xylA,构建pET-28a(+)-xylA 表达载体,并转化至E. coli BL21 (DE3),经异丙基-β -D- 硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并对其表达产物进行SDS-PAGE 电泳。结果表明,融合蛋白分子质量约为45kD。在诱导时间9h、0.6mmol/L IPTG、30℃和OD600nm 值为0.8 的最适培养条件下,酶比活力最高达到62.42U/mL。     

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中表达

构建乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒并表达。以植物乳杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,连接到表达载体pET-32a(+)上,构建的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,菌体总蛋白经SDS-PAGE鉴定显示重组质粒诱导表达产物有特异性蛋白条带。该表达产物经细菌亚硝酸盐还原酶试剂盒测定显示有明显的酶活性。实验结果为深入研究植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶提供有益的参考。     

EGFP-Arg7融合蛋白表达及在HeLa细胞中的转导活性

目的 构建pET-28a-EGFP-Arg7重组子,观察表达的融合蛋EGFP-Arg7在细胞内的转导活性.方法 构建EGFP-Arg7(阴性对照为EGFP)序列,与pET-28a连接后,转化Ecoli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并经Ni2+.NTA纯化.纯化产物作用于HeLa细胞后用荧光显微镜观察其转导活性.结果 重组pET-28a-EGFP-Arg7经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确.转化E.coil BL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达.纯化后的融合蛋白纯度达90%以上.重组蛋白EGFP-Arg7作用于HeLa细胞后用荧光显微镜可观察到强绿色荧光.结论 Arg7具有很好的转导活性,能携带与其连接的蛋白质穿过HeLa细胞膜.     

极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的高效表达

海栖热袍菌 Thermotoga maritima 是嗜极端高温的厌氧细菌,其产生的极耐热葡聚糖酶具有很好的热稳定性和潜在的可观工业用途。但嗜高温菌基因在大肠杆菌中表达水平较低,T．m 内切葡聚糖酶 Cel12B 基因带有信号肽,应用在线预测分析,通过 PCR 方法分别克隆 Cel12B 完整基因和不带信号肽基因至 pET-20b 载体, 构建重组质粒 pET-20b-Cel12B 和 pET-20b-Cel12B-WS,转化至大肠杆菌 JM109DE3诱导表达后,分析酶活,结果表明去除信号肽重组菌单位酶活是未去除信号肽重组菌11倍多。     

褐藻胶裂解酶的基因克隆及表达条件优化

采用大肠杆菌（Escherichia coli）表达海洋弧菌（Vibrio sp.）X511的褐藻胶裂解酶基因,以实现对该酶的大量制备及酶学性质研究。通过序列分析,预测该酶的前20个氨基酸为信号肽,去除信号肽后的蛋白质分子质量约为30 254.28 Da,等电点8.75,分子式为C1368H2100N364O401S6 ,对应的基因序列命名为alg1987。按如下方案构建重组菌：设计特异性核酸引物,PCR扩增得到alg1987;将重组质粒pET-30(a)-alg1987导入大肠杆菌Trans5α进行测序;提取阳性pET-30(a)-alg1987质粒导入大肠杆菌BL21,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测诱导后的重组菌胞液上清,发现异源表达的褐藻胶裂解酶分子质量大小与预测值相近。对重组菌中的褐藻胶裂解酶进行表达条件优化,结果显示,最适参数为诱导温度16 ℃,诱导时间16 h,诱导剂IPTG浓度0.8 mmol/L。     

中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05 α-淀粉酶基因的克隆和原核表达

本实验室从新疆盐湖分离得到一株产α-淀粉酶中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05,根据已报道的α-淀粉酶基因(α-AMY)序列的保守区域设计引物,从中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05基因组中扩增出α-淀粉酶基因片段,将α-淀粉酶基因纯化后克隆到pGM-T载体上测序,结果表明α-淀粉酶基因片段长约1500bp,与地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的α-淀粉酶基因序列的同源性为95%,两种序列具有一定的同源性。按正确的阅读框架将α-淀粉酶基因片段定向克隆到表达载体pET-32a上,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳表明,α-淀粉酶基因能在大肠杆菌BL21中成功表达,确定表达蛋白的相对分子量为61kD左右,与理论推导的分子量相一致;构建的大肠杆菌工程菌,所产生的α-淀粉酶是包涵体,通过超声波粉碎仪粉碎后,测α-淀粉酶酶活为原菌的1.8倍。     

牛凝乳酶全长cDNA的克隆及其原核表达载体的构建

从小牛皱胃中提取凝乳酶(Chymosin)总RNA,经过RT-PCR获得凝乳酶cDNA,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶全长基因序列。序列测定表明,凝乳酶全长核苷酸长度为1 143 bp,编码381个氨基酸。与GenBank上已发表序列NM_180994进行比较,核苷酸同源性为99.56%。将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b/Chymosin,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为凝乳酶的进一步表达奠定了基础。     

小麦蛋白质二硫键异构酶基因的克隆、表达及重组酶性质

目的:克隆小麦蛋白质二硫键异构酶(wheat protein disulfide isomerase,wPDI)基因,实现其在大肠杆菌中的表达并探究其酶学性质。方法:以小麦种子总RNA为模板,逆转录并扩增得到wpdi,并以pET-30b为表达载体、大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌进行原核表达,表达产物经金属螯合层析纯化后进行了酶学性质研究。结果:克隆的基因全长1 548 bp,与"Wyuna"品种小麦wpdi基因相似性达99%。构建了pET-30b-wpdi表达载体,获得w PDI的最佳表达条件为:诱导温度22℃,诱导时间6 h,诱导剂浓度0.5 mmol/L。该酶含4个硫氧还蛋白结构域,分子质量约为66.2 kD,具有二硫键的还原酶和异构酶活性以及分子伴侣活性。结论:对重组wPDI的表达和酶学性质研究,为wPDI在面制品加工及其他方面的应用提供参考依据。     

人工合成的单链甜蛋白monellin基因在大肠杆菌中的高效表达

根据已报道的单链monellin甜蛋白的氨基酸序列,采用细菌偏爱密码子,人工合成了全长294bp的monellin基因。插入到大肠杆菌表达载体pET22b中,构建重组分泌型表达载体pETMO。经IPTG诱导pETMO所含有的甜蛋白基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达量占菌体可溶性蛋白的44.8%。且经纯化后测定其甜度是蔗糖的3000倍。     

碱性芽孢杆菌木聚糖酶基因的克隆及表达

本实验从广西红树林土壤中筛选出一株产木聚糖酶的耐碱菌HSL38,经过16S rDNA鉴定,其与碱性芽孢杆菌Bacillus halodurans C-125(GenBank：NC_002570.2)的同源性达到99%。参考Bacillus halodurans C-125的β-1,4-木聚糖酶基因xynA设计引物,扩增出HSL38中的β-1,4-木聚糖酶基因xyl-BH-G10,其与xynA的同源性达到99%,编码396个氨基酸残基(45.27kD),属于糖基水解酶GH10家族。将xyl-BH-G10基因与表达载体pET-30a-c(+)连接,构建重组载体,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白。结果表明,在最佳诱导条件下,木聚糖酶基因xyl-BH-G10在大肠杆菌细胞内高效表达,酶活力达到55.28U/mL,是原菌株HSL38发酵液酶活力的4倍。