花生过敏原Ara h 2.02 二级结构和B 细胞抗原表位预测

为预测花生过敏原Ara h 2.02 的二级结构和B 细胞抗原表位,通过Genbank 数据库搜索到Ara h 2.02 基因,并推导出其相应的氨基酸序列,采用SOPMA 和DNAStar 软件预测该蛋白质的二级结构以及通过Jameson-Wolf 法、Kyte-Doolittle 法、Emini 法和Karplus-Schulz 法分别预测其抗原指数、亲水性、表面可性、柔韧性等参数,并综合分析预测该蛋白的B 细胞抗原表位。结果表明：在序列28～31、56～73、76～90、92、148、156～158、168～169 区域最可能是Ara h 2.02 蛋白的B 细胞抗原表位的优势区域。该结果将为寻找Ara h 2.02 的最佳优势表位提供支持,同时为该蛋白单克隆抗体的制备等研究提供理论依据。     

大豆球蛋白A1a酸性多肽的原核表达及纯化

为建立大豆球蛋白免疫检测方法及致敏机理的深入研究提供基础材料,人工合成了大豆球蛋白A1a酸性多肽基因的cDNA序列,通过聚合酶链式反应(PCR)和Bam HI、Kpn I双酶切构建了原核表达载体pET30a-A1a,将重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21后用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。SDS-PAGE分析表明,A1a酸性多肽融合蛋白能以可溶蛋白形式进行分泌表达,并且诱导5h后,A1a酸性多肽融合蛋白表达量达到最高。经His亲和层析纯化,获得纯度达90%的融合A1a蛋白,分子质量大小约为38kD。Western blotting显示,所获得的A1a融合蛋白能与对豆粕过敏的仔猪血清发生免疫反应,表明所获得融合蛋白具有免疫活性。     

柑橘PGIP的B细胞抗原表位分析和原核表达

柑橘是重要的经济园艺植物,但是部分人群在食用柑橘后会造成过敏现象,其中多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是柑橘中重要的过敏原。本文利用Jameson-Wolf法、Kyte-Doolittle法、Emini法和Karplus-Schulz法对柑橘过敏原蛋白PGIP的抗原指数、亲水性、蛋白表面可及性及柔韧性进行分析,通过构建PET-28 a-PGIP载体转移到大肠杆菌(Escherichia coli)中进行原核表达。结果表明:当PGIP二级结构是β-转角和无规则卷曲,同时氨基酸序列的抗原指数0、柔韧性0、亲水性0和蛋白表面可及性1时的氨基酸时,过敏原蛋白PGIP的B细胞表位结合氨基酸的序列区域是在19~22、37~41、49~52、68~69、117~120、163~164、173~177、221~226、236~240。通过分析氨基酸的区域及原核表达,为寻找柑橘过敏原蛋白PGIP的B细胞抗原表位的最佳优势区域提供支持,同时也为消除柑橘过敏原蛋白PGIP对人体的影响的进一步研究提供理论基础。     

鸡蛋卵转铁蛋白过敏原B细胞线性表位的预测研究

为预测鸡蛋过敏原卵转铁蛋白的B细胞线性表位,以GenBank中提供的鸡蛋卵转铁蛋白氨基酸序列为基础,分别用Jameson-Wolf法、Kyte-Doolittle法、Emini法和Karplus-Schulz法对鸡蛋卵转铁蛋白的抗原指数、亲水性、蛋白表面可及性及柔韧性进行预测,并用Chou-Fasman法和Deleage-Roux法预测其二级结构,综合分析以上预测结果,得出鸡蛋卵转铁蛋白可能的B细胞线性表位区。结果表明鸡蛋卵转铁蛋白存在7个潜在表位区,包括蛋白第174～181、215～222、231～240、288～294、332～344、415～429、547～555位可能为B细胞线性表位优势区域。该结果将有助于鸡蛋卵转铁蛋白B细胞表位的进一步精确定位。     

榛子主要过敏原Cor h 1单克隆抗体识别抗原表位区域的确定

目的 确定已获得的四株榛子主要过敏原Cor h 1单克隆抗体识别的抗原表位区域。方法 构建谷胱甘肽疏基转移酶 (GST)与Cor h 1不同截短体的表达载体并表达GST-Cor h 1融合蛋白, 采用ELISA和Western blot检测单抗与不同融合蛋白的反应, 并结合DNAstar表位分析软件推知不同单抗的抗原识别表位区域。结果 确定了四株Cor h 1单抗的抗原识别表位区域, 分别是4G7和2H3抗体的抗原表位位于Cor h 1第120~126位氨基酸, 5F2和1G4抗体的抗原表位位于Cor h 1第43~52位氨基酸。结论 四株Cor h 1单抗的抗原识别表位区域的确定, 为Cor h 1的进一步研究和食品安全检测奠定了基础。     

花生过敏原Ara h1免疫显性抗原决定簇的鉴别

为探索花生过敏原致敏机理,采用固相合成肽技术合成Ara h1的23条多肽。以花生过敏患者血清为抗体,鉴别和定位Ara h1的抗原决定簇。结果表明:Ara h1第21～34位,第89～98位,第393～403位,第498～507位,第594～605位氨基酸序列识别率在60%以上,为Arah1的抗原决定簇,其中第498～507位的多肽识别率为100%,是显性抗原决定簇,其氨基酸序列为RRYTARLKEG。用丙氨酸依次取代显性抗原决定簇的每个氨基酸,结果抗原决定簇的致敏性增强或丧失,说明Ara h1第499位和第503位的精氨酸和第502位的丙氨酸为降低Ara h1致敏性的关键氨基酸。     

黄曲霉毒素M1模拟表位的筛选和鉴定

目的:从噬菌体表面7肽库中筛选出黄曲霉毒素M1抗原的模拟表位。方法与结果:经过4轮淘选,筛选获得了4个与抗AFM1单克隆抗体具有较高亲和性的阳性噬菌体克隆,编号为A1、A2、A3和A4。间接竞争抑制实验结果表明:当噬菌体滴度为2.5×1010CFU时,噬菌体A1、A2、A3和A4对AFM1与抗AFM1单克隆抗体结合的抑制率分别为41.8%、40.6%、36.7%和37.6%。测定其核酸序列,其中A1、A2为同一克隆,氨基酸序列为LTSFPRH;A3、A4为同一克隆,氨基酸序列为MAPSSWR。结论:从噬菌体7肽库中筛选到2个AFM1的理想模拟表位。     

TBa过敏原表位区段的融合表达及免疫活性分析

为了确定苦荞过敏原TBa(tartarybuckwheatallergen)的抗原表位及进一步了解荞麦过敏反应机制,本实验以苦荞过敏原TBacDNA序列为模板,设计引物,克隆苦荞过敏原TBa表位区段基因,分别构建TBa及两个表位区段原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达并纯化,采用竞争ELISA对其免疫活性进行分析与比较。SDS-PAGE及WesternBlot鉴定和检测结果表明,目的蛋白在E.coliBL21(DE3)中可高效表达,其N端带有6个组氨酸标签。Ni2+-NTA琼脂糖柱亲和纯化得到了纯度较高的目的片段。ELISA实验结果显示,表达产物与荞麦食品过敏病人血清中的IgE具有特异的结合活性。本研究为揭示苦荞过敏蛋白结构与功能的关系奠定了基础。     

花生主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位的预测及鉴定

花生过敏由于其高致敏率和致敏严重性而引起了人们的广泛关注。Ara h 1是花生中的主要过敏原,属于Cupin超家族,通过抗原表位识别结合免疫球蛋白E引发花生过敏。本研究采用生物信息学分析花生主要过敏原Cupin超家族Ara h 1线性B细胞表位氨基酸组成,及其与Ara h 1二级、三级结构之间关系,通过质谱分析Ara h 1氨基酸序列中的抗消化肽段,并分析抗消化肽段与预测线性B细胞表位的关系。结果表明,Ara h 1的线性B细胞表位富含亲水性氨基酸和带电氨基酸;其二级结构没有明显的分布规律,具有一定的回转折叠结构;分析Ara h 1三级结构发现,表位主要位于单体之间的疏水相互作用区域,部分表位埋入三聚体构象内部;Ara h 1抗消化序列与表位之间存在部分重叠。综上,质谱检测体外模拟胃肠道消化肽段并结合表位生物信息学分析可以作为鉴定Cupin超家族线性B细胞表位的新方法。     

牛乳β-乳球蛋白过敏原线性表位串联体的分子设计

本实验以牛乳β-乳球蛋白中与人血清IgE结合的7个B细胞表位(B1、B2、B3、B4、B5、B6和B7)和1个T细胞表位(T)为研究对象,旨在使设计出的牛乳β-乳球蛋白多表位串联体分子中各表位能够保留独立的抗原性。按照表位串联体设计原则,B细胞表位之间的连接序列为甘氨酸(G),T细胞与B细胞表位之间的连接序列为两个赖氨酸(KK)。通过生物信息学的研究,借助DNAStar软件和SOMPA网络服务器,对这8个表位连接顺序进行优化组合后,设计出的串联体分子组合结构为:T-K-K-B1-G-B6-G-B5-G-B3-G-B7-G-B2-G-B4,其氨基酸序列是:KIPAVFKIDALNENKVLVLDTKKLIVTQTMKGEVDDEALEKFDKALKALPGKTKIPAVFKIDAGKPTPEGDLEILLQKGKALPMHIRLSFNGLLDAQSAPLRVYVEELKPGAQKKIIAEKTKI。经过预测,该串联体中各表位均呈现出了抗原性,且没有新的表位产生。研究结果表明,分子设计正确,研究方法值得同类工作借鉴。     

小菜蛾moricin在毕赤酵母中的表达及抑菌活性分析

抗生素的过度使用给自然生态带来诸多不利影响,寻找合适的抗生素的替代物,从而减少抗生素的使用正成为当下的研究热点。以来自于小菜蛾的特异性抗菌肽moricin为研究对象,研究其酵母异源表达水平和抑菌性能及生化特性,为进一步的开发利用提供理论支持。根据已有的小菜蛾抗菌肽moricin特异性基因信息,采用聚合酶链式反应扩增其成熟肽基因mor-3,并克隆至pGAPZαA质粒中,构建组成型分泌表达载体pGAPZαA-mor3,线性化片段电转化导入毕赤酵母SMD1168菌株,高质量浓度Zeocin筛选获得高拷贝重组转化子。以YPD为培养基进行摇瓶发酵,重组蛋白获得高效表达,分子质量约为5kD,与理论预测的基本一致;发酵60 h,上清液中重组蛋白表达量达248.98 mg/L,而且耐热性能良好,同时具备较强的耐强酸及强碱的能力,特别在强酸环境中活性保持稳定,体现了较好的机体内环境的适应性潜力;对部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有抑菌作用,特别是对革兰氏阴性菌具备特异性较强的抑制作用,对大肠杆菌的最低抑菌浓度为6.25μg/mL,而对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度仅为124.49μg/mL。独特的抑菌性能和理化特点,使其具备广阔的开发应用前景及良好的社会与环保效益。     

重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽在大肠杆菌中的表达纯化及功能鉴定

本研究构建了编码重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽基因的原核表达载体pET28a-rhCⅠ,并将其转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达。采用PCR的方法扩增重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽的cDNA序列,并将其克隆到原核表达载体pET28a上;重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达,并优化表达条件。利用SDS-PAGE和WesternBlot检测表达产物。大量表达重组蛋白,采用镍亲和层析进行纯化,并对纯化后的蛋白进行体外抗氧化研究以及促细胞增殖分析。结果表明,通过大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达获得了分子量约为40ku的重组蛋白,与预期相符。经镍亲和层析获得纯度较高的蛋白,通过DPPH实验证明其有一定的抗氧化活性;而且MTT实验证实该蛋白可以促进小鼠成纤维细胞3T3细胞的增殖,为其在食品、化妆品和医疗行业的应用提供一定的理论依据。     

丝胶抗冻肽在大肠杆菌中的重组表达及其抗冻活性初探

为了高效制备抗冻肽,研究一种丝胶抗冻肽目的基因SerD在大肠杆菌BL21菌株中的重组表达,并分析表达产物的抗冻活性。首先合成SerD基因片段,经KpnI和XhoI双酶切后定向插入质粒载体Pet32a中,构建表达质粒Pet32a-SerD,然后电转化入大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行目的基因表达,利用镍琼脂糖亲和层析对目的重组蛋白进行纯化,并对其进行抗冻活性分析。结果表明,最佳表达条件为重组菌在20℃诱导16 h;通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹试验(Western-Blot)鉴定重组蛋白表达成功且His-SerD融合蛋白表达的分子量在25~35 kDa之间;胞内表达His-SerD融合蛋白的大肠杆菌BL21-SerD复苏后的生长活性明显高于PBL空载菌;添加His-SerD融合蛋白可明显降低溶液中冰晶颗粒大小,具有较好的重结晶抑制效果。本文通过基因工程方法在大肠杆菌中成功构建丝胶肽抗冻肽的重组表达系统,并最终获得具有抗冷冻胁迫保护作用的His-SerD融合蛋白。     

降糖肽Aglycin的高效表达及活性鉴定

基于自组装肽ELK16能在大肠杆菌细胞内自聚集的特性,本研究将Aglycin通过一个内含肽Mxe GyrA与自组装肽连接,构建能在体外自剪切的重组表达载体pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行蛋白表达条件的优化,得到目的蛋白聚集体,随后对聚集体进行DTT切割条件的优化,经过进一步纯化最终可得到纯度为98.15%、产量为5.53mg/g菌体湿重的Aglycin肽。采用基因工程手段重组表达Aglycin的产量比目前化学提取方法提高了近100倍。此外,经体外实验证明,Aglycin对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50(36.48μmol/L)比阿卡波糖(991.33μmol/L)低,说明Aglycin比阿卡波糖有更强的α-葡萄糖苷酶抑制活性,这进一步证明Aglycin有开发为α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜力。     

嗜热古菌高温酸性淀粉酶基因合成和大肠杆菌中的表达

BD5088是来源于1种嗜热球菌Thermococcus sp.的高温酸性α-淀粉酶的人工突变体,研究中根据BD5088基因的氨基酸序列,经密码子优化,用2步PCR法合成去信号肽后的成熟肽基因。该基因全长1311bp,由436个氨基酸组成。现将其克隆到大肠杆菌的表达载体pET30a上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达出的目的蛋白分子量约为48ku,大小与理论值一致,经过Ni+树脂纯化,得到纯化后的重组酶BD5088。重组α-淀粉酶BD5088具有α-淀粉酶的活性,最适反应温度范围为70～85°C,最适反应pH值为5.6～6.0,在100℃下酶活性半衰期约30min。活性不依赖于Ca2+。本研究为该基因在毕赤酵母中的表达和基因的定向进化改造打下了基础。     

Umami taste characteristics of water extract of Doenjang, a Korean soybean paste: Low-molecular acidic peptides may be a possible clue to the taste

We investigated the taste characteristics of doenjang water extract (DWE) for component compounds that contribute to its taste. A 1% DWE solution elicited the highest umami taste ratings in a taste profile test. A 3% solution of DWE was used as substitute for 9.4% of monosodium glutamate in a taste soup base, and it masked the bitter taste of hydrolysed animal protein when mixed in solution. DWE was fractionated, based on molecular weights, and fraction IV (F-IV; 1000 > MW ? 500) had the highest peptide contents and elicited the strongest umami taste. The acidic peptide fraction of F-IV elicited the strongest umami taste. The major bound-type amino acids in DWE, F-IV and the acidic peptide fraction were Glu and Asp. These data show that the umami taste characteristics were a result of the low molecular weight acidic peptides naturally produced during the fermentation of soybeans.     

鲎素Tachyplesin Ⅰ在大肠杆菌中的重组表达及其抑菌活性

为了高效制备抗菌肽,本文将鲎素抗菌肽目的基因Tachyplesin-1(TP1)在大肠杆菌BL21中进行表达。首先构建表达质粒pET32a-TP1并转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行目的融合蛋白表达,并利用His标签与镍柱亲和层析对融合蛋白进行纯化。纯化后的融合蛋白经羟胺裂解液切割和质谱分析后,获得单一的TP1重组蛋白,最后对其抑菌活性进行表征。结果表明,重组菌在37℃经IPTG诱导后,融合蛋白表达成功,TrxA-TP1融合蛋白的分子量在20 kDa左右。经羟胺裂解得到的重组蛋白TP1对于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均具有良好抑菌活性,最小抑菌浓度分别为6和10 mg/L。本研究为鲎素抗菌肽TP1的开发应用和大量生产奠定了基础。     

古细菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从嗜热古细菌Pyrococcusfuriosus的基因组DNA中扩增出胞外α 淀粉酶完整结构基因 ,插入表达载体pET2 8a中构建成质粒 pET amy(sig+) ,以质粒pET amy(sig +)为底物扩增出不含信号序列的α 淀粉酶成熟肽基因片断 ,获得质粒 pET amy(sig ) ,将重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)。在T7启动子和lac操纵子控制下 ,通过IPTG的诱导在重组大肠杆菌细胞内分别表达出含信号肽和不含信号肽的融合蛋白。其中不含信号肽的融合蛋白具有与P .furio sus产生的胞外α 淀粉酶相似的酶学性质 :最适pH为 5 .0 ,最适温度约为 95℃ ,在 1 2 1℃下热处理 1h酶活仍能保持 50 %以上 ;含信号肽序列的基因的表达产物不能测到酶活     

草莓轻型黄边病毒外壳蛋白抗原表位预测、克隆、表达及其免疫原性分析

应用IEDB、DNAStar、DNAMAN和Snap Gene等生物信息学工具对草莓轻型黄边病毒外壳蛋白的氨基酸残基序列进行分析。选择一段抗原性较强的肽段(位于外壳蛋白27~38氨基酸残基处),依据大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子偏好性化学合成了该肽段的DNA编码序列(AE)。AE片段克隆至E.coli表达载体pET32a(+)的Eco RⅠ和XhoⅠ位点,获得重组质粒pET32a(+)-AE。含AE片段的开放阅读框长561 bp,编码了一个187氨基酸残基的重组融合蛋白,理论分子质量为20.29kD。重组质粒pET32a(+)-AE分别在E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta中进行了诱导表达和条件优化。重组融合蛋白在E.coli Rosetta中的最佳表达条件为1.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、35℃诱导表达2 h,产率为13.22 mg/L;在E.coli BL21(DE3)中的最佳表达条件是为0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导表达2 h,产率为9.55 mg/L。重组融合蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、质谱鉴定表明,其含有所预测的草莓轻型黄边病毒外壳蛋白抗原表位肽段AE。AE重组融合蛋白经Ni~(2+)亲和色谱纯化、EK酶切、分子筛除去融合蛋白标签后,免疫产蛋鸡。从免疫鸡所产鸡蛋中提取鸡卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,Ig Y),Dot-Blot检测抗体结合活性。结果表明,所提取的IgY可特异性识别AE肽段和SMYEV外壳蛋白。这一结果表明所预测的AE肽段具有较好的免疫原性。