LCR 6013降解亚硝酸盐的途径及其亚硝酸盐还原酶的初步定位

研究了在De Man, Rogosa and Sharpe medium(简称MRS培养基）体系中NaCl、Vc对Lactobacillus casei subsp. rhamnosus 6013（简称LCR 6013）降解亚硝酸盐的影响。并利用电子捕获-气相色谱法和靛酚蓝染色法确定亚硝酸盐的降解途径。通过测定LCR 6013细胞中不同组分的酶活研究了亚硝酸盐还原酶（Nitrite reductase,NiR）的定位。在MRS体系中,NaCl、Vc浓度分别为0.75 %、0.02 %时,LCR 6013对亚硝酸盐的降解量最高分别为9.29 μg/mL和9.89 μg/mL,与对照比,此降解效果显著（p?0.01）。当NaNO2初始量为10.00 μg/mL时,降解产物中含有28.81?10-6的N2O气体,没有NH4+。当NaNO2初始量为50.00 μg/mL,在16 h时LCR 6013能够将NaNO2完全降解,14 h时N2O体积百分比含量最高为96.61?10-6;细胞周质间隙中NiR酶活是细胞质中的2.5倍。总之,在MRS体系中,LCR 6013能有效降解亚硝酸盐是源于细胞内亚硝酸盐还原酶NiR的作用;最可能通过NO2-?NO?N2O?N2的途径进行降解,而非铵化作用;降解产物中含有N2O气体。     

干酪乳杆菌细菌素的分离纯化及抑菌特性分析

该文从干酪乳杆菌XbC-36发酵液中分离纯化细菌素(命名为BaC21)并分析抑菌特性,为开发为新型食品防腐剂奠定理论基础。硫酸铵盐析、Sephadex G-15柱层析和半制备高效液相色谱法纯化BaC21。三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,Tricine-SDS-PAGE)法测定细菌素分子质量。菌株XbC-36在MRS培养基中发酵稳定期前期(18 h)细菌素达到最大产量1 695 AU/mL。BaC21分子质量4.4 kDa,与其他细菌素分子质量不同,推测为一种新型细菌素。BaC21在37～100℃加热30 min抑菌活性几乎无变化,120℃加热15 min抑菌活性下降,但没有完全丧失,表明具有较高热稳定性; BaC21在pH 2～8保持稳定;有机溶剂和表面活性剂对BaC21抗菌活性无影响,但SDS能提高其抗菌活性;经多种蛋白酶处理后,其抑菌活性完全失活,而脂肪酶和α-淀粉酶则无明显作用,表明BaC21具有蛋白质性质。BaC21具有广谱...     

干酪乳杆菌LC2W胞外多糖的分离纯化及性质研究

干酪乳杆菌LC2W发酵脱脂乳上清液通过添加三氯乙酸除蛋白，酒精沉淀得粗胞外多搪LCP；粗多糖LCP经DE-AE-Sepharose FF离子交换柱分离得到三个组分（LCP1、LCP2和LCP3）．主要组分LCP1经高效体积排阻色谱和毛细管电泳鉴定为均一组分，分子量为3.27×10^6 Da。紫外光谱测定表明：LCP1不含蛋白质和核酸；红外光谱测定表明：LCP1具有多糖的特征吸收峰；气相色谱测其单糖组成（质量比）为鼠李糖：半乳糖：葡萄糖=0.4353：0.2514：1。     

自然发酵肉制品中干酪乳杆菌的分离和鉴定

从自然发酵香肠和自制腌肉中分离得到68株乳酸菌,通过对菌株发酵适应性的研究,筛选出2株性能优良,适用于肉制品发酵的乳酸菌C67和R6,初步生化鉴定表明,2株均为干酪乳杆菌。文中还对所获得的菌株的相关发酵性能进行了测试。     

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中表达

构建乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒并表达。以植物乳杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,连接到表达载体pET-32a(+)上,构建的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,菌体总蛋白经SDS-PAGE鉴定显示重组质粒诱导表达产物有特异性蛋白条带。该表达产物经细菌亚硝酸盐还原酶试剂盒测定显示有明显的酶活性。实验结果为深入研究植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶提供有益的参考。     

植物乳杆菌DMDL 9010中亚硝酸盐还原酶的基因克隆、表达和纯化

研究了植物乳杆菌DMDL 9010亚硝酸盐还原酶基因克隆、表达及表达产物的纯化。首先以植物乳杆菌DMDL 9010的DNA为模板,利用PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,扩增后nir编码序列大小为1638 bp,再将其编码序列克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,转化到感受态细胞DH5α,成功构建重组质粒p ET-32a(+)-nir。将重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株E.coli BL21中,在IPTG浓度为1 mmol/L和诱导温度为25℃的条件下诱导4 h后诱导表达NIR蛋白,经诱导后的工程菌能将50μg/m L的亚硝酸盐降解90%以上,利用亲和层析柱Ni sepharose 6 Fast flow进行纯化得到重组蛋白,该重组蛋白经SDS-PAGE电泳后的分子量约为60 KDa。总之,经由植物乳杆菌DMDL 9010克隆出亚硝酸还原酶基因,并成功构建了重组质粒p ET-32a(+)-nir,利用基因工程方法得到的工程菌能有效降解亚硝酸盐,并能利用亲和层析得到高纯度的NIR。     

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶相关基因的研究

植物乳杆菌具有降解亚硝酸盐的能力。根据已知四种类型亚硝酸盐还原酶蛋白序列的保守序列,利用互联网相关蛋白分析软件及生物信息学工具,查找到植物乳杆菌基因组上的亚硝酸盐还原酶疑似基因8个,克隆出全部基因序列,分别构建表达载体p ET-32a(+)-Ni Rs。将构建的质粒转入BL21(DE3)表达菌的感受态细胞中进行诱导表达,表达的目的蛋白,经亚硝酸盐还原酶总活性测定试剂盒检测,结果显示,其中HP蛋白具有显著还原亚硝酸盐的能力。     

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中重组表达、纯化及酶学性质分析

构建植物乳杆菌(Lactobacillus sp.LMY-20)中亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,NiR)的重组大肠杆菌、纯化重组蛋白并对其进行酶学性质分析。将人工合成的密码子优化的亚硝酸盐还原酶基因(nir)亚克隆至载体pET28a(+),构建重组表达载体p ET28a(+)-nir并转化到E.coli BL21(DE3)中实现表达。包涵体复性,利用镍柱亲和层析纯化重组亚硝酸盐还原酶。成功构建产亚硝酸盐还原酶的重组大肠杆菌并纯化了重组亚硝酸盐还原酶,纯化后经变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析在45 k Da附近出现明显条带。Na_2S_2O_4-MV法测得酶活为2 332.72 U/L,最适pH值为6.5,最适作用温度为37℃,在4～70℃下孵育40 min后可保持超过85%的活力。该研究实现植物乳杆菌来源的NiR在大肠杆菌中的重组表达、纯化及其酶学性质分析,重组NiR具有较好的温度适应性和稳定性,为其在农业、食品及医药等领域应用奠定基础。     

西藏干酪源植物乳杆菌产细菌素的分离纯化及特性研究

从西藏干酪中分离筛选出1株能够产生抑菌活性物质的乳酸菌,该菌的发酵上清液在排除有机酸、过氧化氢的影响后仍有显著抑菌活性,然而,用胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶处理后抑菌活性丧失,说明该菌的代谢产物中起抑菌作用的物质具有蛋白质性质,初步确定是一种细菌素。结合形态学观察、生理生化分析及16S rDNA鉴定结果,确定该菌为植物乳杆菌,命名为ZFM804。细菌素经大孔树脂(XAD-16)层析、强阳离子交换层析、RP-HPLC三步法初步纯化。经SDS-PAGE分析该细菌素分子质量约为15 ku。理化性质分析表明该细菌素具有良好的酸碱稳定性:在pH 3~11范围内都具有抑菌活性;良好的热稳定性:100 ℃处理30 min仍有明显抑菌活性,同时可被人体内蛋白酶降解。抑菌谱测定结果表明,ZFM804植物乳杆菌素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑制作用,是一种广谱细菌素。     

四川泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因克隆与表达

目的:对植物乳杆菌中亚硝酸盐还原酶基因进行克隆并表达,并测定酶的活力。方法:根据Gen Bank中亚硝酸盐还原酶（NIR）基因序列,设计引物。提取植物乳杆菌的DNA,采用PCR技术扩增nir基因,TA克隆构建获得重组质粒p MD19-nir,分析其核苷酸序列同源性。通过双酶切连接到表达载体p ET-32a（+）中,获得重组表达载体p ET-32a-nir,构建成功后转化到E.coli BL（DE3）中进行表达研究。经IPTG诱导表达,得重组蛋白,超声波破碎,提取粗酶液,测定酶活力。结果:克隆的目的基因序列长度为1638 bp。获得重组蛋白分子量为80 ku,酶活力为4.2 U/mg。结论:成功克隆了植物乳杆菌中的亚硝酸盐还原酶基因,成功的导入到E.coli BL（DE3）中,表达产物有酶活。      

干酪乳杆菌6033蛋白酶降解肌肉蛋白质的作用研究

本试验将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，Lc)6033蛋白酶液按5％的比例分别加入肌浆蛋白和肌原纤维蛋白提取液，然后设定不同的pH值，于15℃培养7d，定时取样，测定反应后的pH值、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白质的变化。结果发现：不同设定的肌浆蛋白和肌原纤维蛋白试验组在反应初期pH值均稍稍降低，随着反应进程，各试验组的pH值呈现出逐步升高的趋势；其中，肌浆蛋白以pH5．0、4．5组的变化较为明显，肌原纤维蛋白则以pH6．0、5．0、4．5组的变化较为明显。经7d振荡培养后，电泳检测发现，各试验组肌浆蛋白均表现出分解现象，尤其以pH5．0组和pH4．5组更为明显；而肌原纤维蛋白也都表现出了明显的分解现象，尤以pH5．0组肌原纤维蛋白分解最明显。     

乳酸菌亚硝酸盐还原酶制备及酶学性质

研究乳酸菌亚硝酸盐还原酶制备。将细胞破碎、硫酸铵盐析从乳酸菌中提取亚硝酸盐还原酶,经DEAE-52纤维素柱层析、Sephadex G-150凝胶过滤纯化,获得酶制品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得相对分子质量约为42kDa。酶学性质分析表明,最适温度30℃,最适pH 5.5,以亚硝酸钠为底物,酶的Km值为120.5ug/mL。     

Purification and characterization of intracellular proteinase from Lactobacillus casei ssp. casei LLG

The intracellular proteinase of Lactobacillus casei ssp. casei LLG was isolated in the cytoplasmic fraction with 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.5). The enzyme was purified by the fast protein liquid chromatography system equipped with ion-exchange and gel filtration chromatographies. This proteinase comprised a single monomeric form and had a molecular weight of about 55 kDa and an isoelectric point near pH 4.9. The optimum pH and temperature for the enzyme activity were determined to be pH 6.5 and 37 degrees C, respectively. The enzyme was inactivated by metal-chelating compounds (EDTA, 1,10-phenanthroline) and less affected by serine proteinase inhibitors (diisopropylfluorophosphate, phenylmethylsulfonyl fluoride). Proteinase activity was increased by Ca++, Mn++, and Co++, and inhibited by Cu++, Mg++, and Zn++. The activity of this enzyme to hydrolyze casein appeared to be more active on beta-casein than alphas1-casein and kappa-casein as monitored by polyacrylamide gel electrophoresis.     

蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus LJ01中亚硝酸盐还原酶的基因克隆、表达和纯化

利用克隆表达技术,对一种蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus LJ01的亚硝酸盐还原酶（nitrite reductase,NiR）基因进行克隆、原核表达,利用Ni柱亲和层析和DEAE Sepharose Fast Flow交换层析对表达的重组NiR进行纯化,分析重组酶的性质。研究结果显示,该NiR含有一个1?623?bp的开放阅读框,编码540?个氨基酸序列,重组NiR的分子质量约为67?ku;该酶中同时存在铁离子和铜离子,且含量分别为51.0?mg/kg和184.5?mg/kg;圆二色谱结果显示α-螺旋结构在重组NiR中所占比例最大。     

干酪乳杆菌胞外多糖LCP1的流变性研究

通过对干酪乳杆菌LC2W胞外多糖LCP1溶液流变性质研究发现,高浓度LCP1溶液呈剪切变稀,低浓度时,剪切速率对黏度没有影响,溶液黏度随温度升高下降明显,pH对LCP1溶液黏度影响很小,盐可以降低LCP1溶液黏度,但黏度降低与盐浓度有关,通过黏弹性研究发现LCP1水溶液不能形成胶体,乌氏黏度计测得LCP1水溶液固有黏度[η]为1.930 dL/g。     

乳酸菌降解亚硝酸盐和反硝化细菌亚硝酸盐还原酶结构研究进展

亚硝酸盐具有发色、杀菌、抗氧化、增强风味等功能,是常见的食品添加剂。亚硝酸盐使用不当会引起食品安全问题,严重影响消费者的健康。因此,高效降低亚硝酸盐残留,解除亚硝酸盐威胁,从而保证食品安全显得越发重要。文章综述了近年来乳酸菌降解亚硝酸盐、反硝化细菌在极端条件下降解亚硝酸盐以及反硝化细菌亚硝酸盐还原酶结构特点相关研究。