烟草ACO基因家族鉴定和二氯喹啉酸药害条件下的表达分析

烟草二氯喹啉酸药害是影响我国烟叶原料保障的重要问题之一,药害机制可能与乙烯合成相关。为了明确二氯喹啉酸药害的作用机制,对烟草1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase,ACO）基因家族进行鉴定,并对二氯喹啉酸药害条件下的基因表达模式进行分析。结果表明:普通烟草、林烟草、绒毛状烟草分别含有19、9和10个ACO基因。亚细胞定位预测分析显示,几乎所有蛋白均定位于细胞质中。进化分析表明,烟草ACO蛋白家族进化形成三类,Ⅰ类成员最多,Ⅱ类成员最少。MicroRNA靶点分析发现,普通烟草6个ACO含有潜在的miRNA靶点。启动子分析表明,普通烟草ACO启动子区含有激素反应、低温反应、抗性和胁迫反应等多种类型的顺式作用元件。二氯喹啉酸处理下的基因表达分析显示,普通烟草ACO家族所有成员均受二氯喹啉酸诱导上调表达,Ntab0263610、Ntab0263620、Ntab0220530和Ntab0220520 4个基因的上调幅度最大,推测这些基因在烟草二氯喹啉酸药害引起的乙烯合成中发挥关键作用。      

烟草ACS基因家族鉴定及二氯喹啉酸胁迫条件下的表达分析

二氯喹啉酸药害给烟叶生产造成较大影响。为明确烟草二氯喹啉酸药害的发生机制,对1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACS)基因家族进行了鉴定,并对二氯喹啉酸胁迫条件下的基因表达模式进行分析。结果表明,普通烟草共有26个ACS基因。染色体定位分析显示,23个ACS基因定位在染色体上,3个定位在scaffold上。亚细胞定位分析显示,ACS主要定位于细胞核或细胞质中。进化分析表明,ACS蛋白进化形成3个类别。序列比对显示,ACS氨基酸序列含有家族保守结构域和活性位点。启动子分析发现,ACS基因启动子区含有脱落酸、茉莉酸、水杨酸、生长素和赤霉素5种激素反应共10种类型的顺式作用元件。表达分析显示,大部分ACS家族成员均受二氯喹啉酸诱导而上调表达。      

烟草TPP基因家族鉴定及表达模式分析

海藻糖-6-磷酸磷酸酶（TPP）是植物海藻糖代谢过程的关键酶,在植物的生长发育及非生物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。为挖掘参与烟草发育及抗逆胁迫的TPP基因家族成员,本研究通过生物信息学的方法,在普通烟草基因组中共鉴定出了15个TPP基因,其中7个TPP基因定位在染色体上。系统进化分析发现,新鉴定的烟草TPP成员可分为3个亚家族,分别为CLASS Ⅰ、CLASS Ⅱ和CLASS Ⅲ。共线性分析表明,有5个烟草Nt TPP基因分别与7个拟南芥AtTPP基因形成同源基因对。启动子分析发现,NtTPP成员的启动子上存在多种激素和非生物胁迫响应元件。表达模式分析发现,NtTPP基因表达具有一定的组织特异性,大部分NtTPP基因在根中的表达量最高,有12个NtTPP基因在干旱胁迫下表达量上调,13个NtTPP基因能够被盐胁迫显著诱导表达。这说明NtTPP基因家族成员在烟草非生物胁迫应答中发挥着重要作用。     

绒毛状烟草钙依赖蛋白激酶基因家族分析

钙依赖蛋白激酶(CDPK)是一个多基因家族,在植物的钙信号转导中具有重要作用。以拟南芥、普通烟草和烟草属其他种中已知的CDPK序列检索绒毛状烟草基因组框架图数据库,获得绒毛状烟草CDPK基因,并对其进行基因结构、GC含量、系统进化关系、主坐标和基因表达谱分析。结果表明：共分离获得25个绒毛状烟草CDPK基因,它们均具有完整的开放读码框;系统进化树和主坐标分析证实这25个CDPK分布于4个亚家族中;RT-PCR分析显示,绒毛状烟草CDPK基因家族的空间表达存在明显的差异性。此为进一步阐明CDPK基因家族在烟草的钙信号转导过程中的功能及分子机制奠定了重要基础。     

烟草DGAT基因家族全基因组鉴定与分析

二酰甘油酰基转移酶（DGAT）是三酰甘油合成的关键酶和唯一限速酶。在烟草中鉴定DGAT基因对于研究油脂代谢途径和创造具有附加值的新型油料作物具有重要意义。本研究从烟草基因组鉴定DGAT家族基因,并对序列特性、基因结构、亚细胞定位、进化模式、表达模式等进行分析。结果表明,共获得25个烟草DGAT家族蛋白,其平均氨基酸长度为485,大部分为碱性蛋白和亲水性蛋白,有13个DGAT蛋白定位到8条连锁群上;有16个蛋白定位到内质网,6个定位叶绿体,3个定位到胞外;烟草DGAT蛋白包含典型的WS_DGAT结构域和LPLAT结构域;系统发育树将DGAT家族分为DGAT1、DGAT2、DGAT3和WSD等4个类群,但烟草DGAT仅划分到DGAT2和WSD两个类群;不同烟草DGAT基因的时空表达特性有所差异,并表现出一定的组织特异性,主要集中在衰老叶片和花器官中大量表达。     

普通烟草脂氧合酶基因家族鉴定及表达模式分析

脂氧合酶（LOX）是脂肪酸代谢途径的关键酶,在植物的生长发育及多种逆境胁迫响应过程中发挥重要作用。本研究对烟草基因组中的LOX家族成员进行鉴定,并利用进化分析、共线性分析和表达分析等方法解析LOX家族成员的潜在生物学功能。结果表明,在普通烟草中共鉴定得到18个LOX基因,其中12个LOX基因被锚定在染色体上。系统进化分析表明,普通烟草中新鉴定的LOX家族成员被分为9-LOX和13-LOX两个亚家族,其中13-LOX又可被分为Type I和Type II两个亚类。共线性分析表明,烟草NtLOX07、NtLOX10基因分别与拟南芥AtLOX05、AtLOX01基因形成同源基因对,并且大部分同源基因之间具有相似的表达模式。表达模式分析发现,普通烟草LOX基因表达具有一定的组织特异性,并且NtLOX06等基因能够被机械损伤和茉莉酸甲脂（MeJA）处理显著诱导。因此,普通烟草LOX家族成员可能在植物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。     

烟草OSCA基因家族鉴定及非生物胁迫诱导表达模式分析

高渗门控钙渗透通道(OSCA,hyperosmolal-gatedcalcium-permeable channel)是一种Ca²⁺非选择性阳离子通道,OSCA家族含有钙依赖性通道DUF221结构域。为了进一步了解烟草OSCA基因家族特征和功能,本研究从栽培烟草K326基因组中鉴定到23个OSCA家族基因,并对NtOSCA家族系统进化关系、基因结构与蛋白结构域、启动子、不同组织器官及干旱和盐胁迫下表达模式进行分析。根据进化关系,NtOSCA基因家族被分为4个亚家族,并且同一亚家族成员间蛋白及基因结构相似。启动子分析结果表明,NtOSCA家族基因启动子中存在着多种不同的胁迫响应元件,其中干旱响应元件和脱落酸响应元件较多。进一步组织表达分析结果表明,NtOSCA基因家族成员在不同组织的表达量不同。干旱和盐胁迫表达模式分析表明,20个NtOSCA基因在干旱胁迫下表达量上调,15个NtOSCA基因在盐胁迫下表达量上调。这说明OSCA基因家族在烟草抗旱和抗盐胁迫中具有重要作用。     

烟草Hsp70基因家族的鉴定及NtHsp70Chl基因的表达分析

为探明烟草热激蛋白70（Hsp70）基因家族的特征及烟叶主脉中NtHsp70Chl基因在烘烤条件下的表达模式,对Hsp70基因家族进行了亚细胞定位、系统进化、基因结构、染色体定位,并对NtHsp70Chl基因进行了烘烤条件下实时荧光定量表达PCR分析。结果表明,烟草基因组中Hsp70基因家族共有61个成员,蛋白序列长度不等,等电点在4.52~9.75范围内,各成员蛋白分别定位于细胞质、内质网、细胞外基质、叶绿体和线粒体中;烟草Hsp70基因家族分为6组,定位于叶绿体的成员均存在Ⅵ-a亚组;61个NtHsp70基因分布于18条染色体上,经亚细胞定位于叶绿体的基因分别位于6、17和19号染色体上;烟草Hsp70家族中具有10个基因重复和5个旁系同源基因;经RT-qPCR检测分析,定位于烟草叶绿体中的NtHsp70Chl基因对高温诱导的敏感性较弱。本研究为深入研究烟草Hsp70的功能奠定了基础。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因家族的全基因组鉴定

为了揭示烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)基因家族的特征和功能,利用生物信息学方法对烟草GGPPS家族进行了全基因组查找、鉴定及相关分析。在普通烟草中共鉴定出9个成员(大亚基7个、小亚基2个),林烟草、绒毛状烟草中分别鉴定出5个成员(大亚基4个、小亚基1个)。GGPPS的开放阅读框长度为999~1 119 bp,编码332~372个氨基酸,蛋白质分子量为36.2~40.7 kD,等电点为5.41~8.32。大亚基和小亚基基因分别含有1个和2个外显子;大亚基与小亚基均具有DD(XX)_1-2D和CXXXC保守性基序,但存在一定的差异。在进化过程中,烟草GGPPS家族可能发生了串联重复复制和片断复制;普通烟草GGPPS家族可能发生了基因丢失,NtabGGPPS1-1和NtabGGPPS1-2较其他成员进化速率快,同时可能受到了净化选择。      

烟草PPO基因家族鉴定与不同成熟度烟叶烘烤过程中PPO活性分析

【背景与目的】多酚氧化酶（PPO）参与的棕色化反应是生产高品质烟草产品的关键环节,为了明确烟草中PPO基因的结构与功能。【方法】通过生物信息学的方法鉴定烟草PPO基因家族成员及其特征;利用qRT-PCR方法分析了翠碧一号上部4种成熟度烟叶（M1～M4）PPO基因的表达,并采用多酚氧化酶活性检测试剂盒测定烘烤过程中烟叶PPO酶活性变化。【结果】烟草基因组中共鉴定到12个NtPPO基因,大多数成员具有类似的基因结构、相近的蛋白长度和保守的蛋白结构域。系统进化分析将菠萝、高粱、番茄、马铃薯和烟草的PPO蛋白分为3个亚族,其中Ⅱ,Ⅲ亚族中均为双子叶植物的PPO成员。NtPPOs基因家族成员的表达量随着成熟度提高表现出不同的变化模式,大多数成员在过熟烟叶中表达量最低。烘烤过程中不同成熟度烟叶中PPO活性也存在明显差异,其中M2、M3和M4成熟期烟叶PPO活性呈现先下降后上升再下降的趋势,在45℃达到最大值,且M2>M3>M4。【结论】研究结果可为烟草PPO基因的功能研究、烟叶棕色化的调控和品种遗传改良奠定基础。     

几丁质酶基因在烟草栽培品种中的表达

利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）对来源于一种生物杀虫剂（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）的几丁质酶基因进行体外扩增，并插入载体质粒ｐＲＯＫ２中，然后转化大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＸＬ１Ｂｌｕｅ。用重组质粒ｐＲＯＫ２ＤＮＡ转化植物转基因载体——土壤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株。借助于土壤农杆菌侵染烟草叶圆片，将目的基因导入。通过组织培养诱导生芽和生根，获得烟草再生植株。利用含卡那霉素的培养基对再生烟株进行初步筛选。进一步ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测结果表明：转基因烟草中有几丁质酶基因和蛋白的表达。初步检测结果表明：转基因烟草具有较高的几丁质酶活性。     

Identification of a triacylglycerol lipase gene family in Candida deformans: molecular cloning and functional expression

The yeast Candida deformans CBS 2071 produces an extracellular lipase which was shown to catalyse the production of various esters by the esterification of free fatty acids, even in the presence of a large molar excess of water. To clone the gene encoding this extracellular lipase, Saccharomyces cerevisiae was transformed with C. deformans genomic libraries and screened for lipolytic activity on a medium containing rapeseed oil emulsion and rhodamine B. Three members of a lipase gene family (CdLIP1, CdLIP2 and CdLIP3) were cloned and characterized. Each deduced lipase sequence has a Gly-His-Ser-Leu-Gly-(Gly/Ala)-Ala conserved motif, eight cysteine residues and encodes an N-terminal signal sequence. MALDI-TOF mass spectrometry analysis of a proteolytic digest of the lipase produced was used to obtain experimental evidence that the CdLIP1 gene encoded the extracellular lipase. Recombinant expression studies confirmed that the cloned genes encoded functional lipases. The three lipases are very similar to lipases from the related species Yarrowia lipolytica. Significant homologies were also found with several yeast and fungal lipases. As C. deformans CBS 2071 was previously considered to be synonymous with Y. lipolytica, the strains were compared for the extent of nucleotide divergence in the variable regions (D1/D2) at the 5'-end of the large-subunit (26S) ribosomal DNA (rDNA) gene. This rDNA region has diverged sufficiently to suggest that C. deformans is a separate species. The nucleotide sequences of the CdLIP1, CdLIP2 and CdLIP3 genes will appear in the EMBL nucleotide sequence database under Accession Nos AJ428393, AJ428394 and AJ428395, respectively.     

抗赤星病烟草的防卫基因的表达与基因组DNA结构的变化

用赤星病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｍａｔａ）毒性菌株产生的ＡＴ毒素诱导烟草,可使寄主获得对赤星病８０．４％的系统抗性,比病菌弱毒株ＴＢＡ１６孢子诱导的效果高约２０％。烟草品种ＮＣ８９心叶叶碟在含ＡＴ毒素６０％和７０％的ＭＳ培养基上经２轮胁迫筛选和植株再生,得到抗病品系ＮＣ８９－ＴＴ。用５种防卫基因的ｃＤＮＡ探针检测了不诱导、受ＡＴ毒素诱导、受病菌弱毒株激发子诱导的ＮＣ８９和诱导与不诱导的ＮＣ８９－ＴＴ第４代植株５种基因的转录活性,结果表明,苯丙氨酸氨裂解酶（ＰＡＬ）基因在ＮＣ８９中不能组成型表达,可被ＡＴ毒素诱导激活,但不受激发子诱导;病程相关蛋白（ＰＲ蛋白）ＰＲ－ｌａ、查尔酮合成酶（ＣＨＳ）、脂氧合酶（ＬＯＸ）基因在ＮＣ８９中表现为诱导转录或诱导后转录活性增强;这４种基因都在ＮＣ８９－ＴＴ中组成型表达     

施用花生壳的烟草叶中基因差异表达分析

以拟南芥基因芯片技术检测施用花生壳作基肥的烟草叶中基因表达的结果表明,在22810个基因微矩阵点中,有效差异表达（logratio值≥1或logratio值≤-1）的基因有54个,上调35个,下调19个。其中包括与植物抗病性、脂类代谢、光合系统以及标志烟株碳代谢指标的基因、蛋白质链合成延伸阶段交替的与核糖体结合、呼吸链电子传递NADH脱氢酶亚基,以及与ATPase有关的基因。此外,还检测到22个未知功能的差异表达基因。结果表明,施用花生壳作为基肥对烟草生长发育的影响是综合的、多效的、明显的。     

太平洋牡蛎中类FUT10蛋白的原核表达及免疫印迹鉴定

目的 原核表达牡蛎类FUT10(Fucosyl-transferase 10)蛋白并探究与人FUT10的免疫相似性。方法 本研究基于课题组前期克隆完整的类FUT10基因cDNA, 依照大肠杆菌表达蛋白的密码子偏爱性, 利用DNAMAN软件对类FUT10基因开放阅读框序列进行优化并合成, 亚克隆至载体pET-28a(+), 得到重构质粒pET-OFu3, 转入大肠杆菌BL21(DE3), 通过异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获取目的蛋白, 进行蛋白质印迹法(Western blot)鉴定。结果 在37 ℃、IPTG终浓度为1.0 mmol/L诱导4 h后, 出现蛋白分子量大小约为55 kDa的条带。该蛋白条带与抗6×His(组氨酸)标签抗体、抗人FUT10抗体均能发生特异性结合。结论 优化后的类FUT10蛋白与人体转移酶FUT10具有相似的免疫原性, 类FUT10蛋白的可溶性表达为探究太平洋牡蛎体内Ⅱ型血型抗原合成路径提供研究基础, 进一步探索了牡蛎体内特异性结合诺如病毒的分子机理。     

烟草bZIP基因家族的鉴定及其在不同成熟度烟叶中的表达分析

通过生物信息学方法,从普通烟草中共鉴定了 126个bZIP家族基因.基因结构分析表明:不同成员间外显子数目差异较大,最大达到13个,最少仅为1个.进化分析发现:126个NtbZIP基因被聚为11个亚族,同一亚族中的基因成员大多具有相似的外显子组成.bZIP结构域分析表明:家族成员的核心结构域非常保守,各成员都具有碱性区...     

Identification of polyphenols in tobacco leaf and their antioxidant and antimicrobial activities

Crude polyphenols were extracted from tobacco leaf by 80% ethanol solution with ultrasonic treatment and then purified by a macroporous resin. The polyphenols from tobacco leaf (PTL) were subjected to analyses by reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) and electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). The dominant polyphenols in tobacco leaf were identified as chlorogenic acid and rutin. Furthermore, the antioxidant activities of PTL were investigated, including scavenging activities of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radicals (5.02 μg/ml IC₅₀ value), hydroxyl radicals (49.6 μg/ml IC50 value) and superoxide anion radicals (44.0 μg/ml IC₅₀ value), inhibition activity of lipid peroxidation (132 μg/ml IC₅₀ value) and reducing power. The proliferation inhibition activities on Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis were also measured for evaluating the antimicrobial activity of PTL. The diameters of inhibition zones were 20.23 ± 0.42, 17.66 ± 0.86 and 12.89 ± 0.29 mm, respectively. The results showed that PTL had great potential as antioxidant and antimicrobial agent.     

大豆rbcL基因克隆、序列分析及原核表达

利用叶绿体基因组保守性的特征,根据菜豆、豌豆、烟草的rbcL基因序列设计引物,从大豆叶绿体DNA中克隆rbcL基因,全长序列为1488bp,包括1449bp的开放阅读框,编码482个氨基酸。相似性比较显示,此序列与其它10个物种rbcL基因核苷酸的同源性为85．37％～95．31％,氨基酸的同源性为90．87％-96．47％。将该基因与表达载体pET-30a（＋）连接,转化大肠杆菌Rosseta感受态细胞,PCR和酶切鉴定筛选阳性克隆,阳性菌液IPTG诱导后经10％SDS—PAGE分析,结果显示,诱导表达出分子量约为60kD的特异融合蛋白。