过表达三七PnSS基因对烟草萜类物质含量及生长发育的影响

为明确PnSS基因在调节烟草萜类物质含量中的作用,构建了PnSS基因过表达载体,并通过叶盘法转化烟草品种巴斯玛14号,获得了PnSS基因过表达烟草植株,最后利用HS-SPME-GC/MS分析转化烟草叶片中的香味物质含量（质量分数）。结果表明：(1)PnSS的氨基酸序列与其在烟草中同源物NtSS具有81.9%的一致性,并含有角鲨烯和植烯合成酶结构域。(2)PnSS基因的过表达导致烟草植株变矮、叶片变小;与根和茎相比,叶片中PnSS基因表达量最高。(3)PnSS基因的过表达使烟叶中乙酸、糠醇、4,6-二甲基嘧啶、苯乙醛、3,5-二甲基苯甲醛、二烯烟碱、二氢猕猴桃内酯、2-甲基吡嗪、壬酸、异戊醛、2-甲基丁醛、西松烯和烟碱13种香味物质含量增加,2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、2,3-联吡啶、植醇、苯乙醇、新植二烯、苯甲醛和麦斯明7种香味物质含量降低。因此,过表达PnSS基因会抑制烟草植株的生长发育并改变烟叶中萜类物质等香味物质的含量。     

烟草NtGGPPS4基因的克隆和功能初步分析

为明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因Nt GGPPS4的功能,从普通烟草中克隆到该基因,构建了超量表达载体p CAMBIA1300-Nt GGPPS4,并通过农杆菌介导法转化烟草。进一步测定了转基因烟株中西柏烷二萜醇和质体色素的含量。结果表明:共鉴定出4株Nt GGPPS4表达量明显升高的转基因植株,且转基因植株中α-西柏三烯二醇(α-cembrenediol,α-CBD)和β-西柏三烯二醇(β-cembrenediol,β-CBD),以及新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素等6种质体色素含量都有显著提高。表明Nt GGPPS4参与了烟草西柏烷二萜醇和类胡萝卜素的生物合成。     

酿酒酵母关键节点基因缺损对法尼烯合成的影响

以法尼烯为评价效应物,研究了缺损乙醇合成途径、甘油合成途径、胞质乙酰辅酶A转运途径和法尼基焦磷酸消耗支路关键基因对酿酒酵母WHE4菌株合成法尼烯的影响。通过CRISPR-cas9基因编辑技术,获得8株关键基因缺损菌株。结果表明,与WHE4菌株相比,缺损乙醇脱氢酶基因ADH3-6对乙醇和法尼烯产量没有影响;单独缺损甘油三磷酸脱氢酶基因GPD1和GPD2使甘油积累量分别降低了15%和34%,缺损半乳糖激酶基因GAL1、GAL7、GAL10下调了甲羟戊酸途径所有基因转录水平,它们的缺损均不能提高菌株的法尼烯产量;缺损香叶基香叶基焦磷酸合酶基因BTS1和二酰基甘油二磷酸磷酸酶基因DPP1,法尼烯产量提高了29%,在5 L发酵罐补料分批发酵,菌株WHE4-33(WHE4 Δbts1,Δdpp1)的法尼烯产量达到1 578.91 mg/L。该研究对甲羟戊酸途径上游和下游关键节点基因进行了缺损影响法尼烯合成研究,为构建酿酒酵母萜类化合物高效平台提供了参考价值。     

烟草“8306”NtCPS2基因敲除及叶面化学成分改良

8306是重要的高香气烤烟育种材料,因其腺毛分泌物中含有赖百当化合物而使其杂交后代具有晾晒烟香气特征。为此,本研究利用CRISPR/Cas9技术,对8306中赖百当生物合成途径的关键酶基因NtCPS2进行敲除,获得了gRNA区发生单碱基插入突变导致翻译提前终止的纯合突变体8306-1。与8306相比,该突变株系生长发育正常,腺毛类型和腺毛密度无显著变化;利用GC-MS技术对叶面化学成分进行检测,在8306-1中并未发现8306中所含有的顺冷杉醇和赖百当二醇等赖百当类化合物,而腺毛分泌物的其他主要成分,如西柏三烯一醇、西柏三烯二醇及蔗糖酯的含量与对照相比并无明显变化;RT-PCR检测分析显示,8306-1与8306中MEP途径及二萜生物合成途径的关键基因,如NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtGPPS、NtGGPPS、NtCYC、NtCYP71D16等在转录水平上的表达均无明显差异。该研究结果表明,NtCPS2基因敲除能有效降低烟草赖百当类二萜化合物的含量,而对叶面其他化学成分及类萜途径基因表达无明显影响。因此,NtCPS2基因是进行烟草叶面化学成分定向改良的理想靶点,对烤烟高香气育种具有重要意义。      

NtGGPPS4基因RNAi载体构建与功能分析

为研究NtGGPPS4在合成烟草萜类化合物中的功能,构建了该基因的RNAi表达载体pHellsgate2-NtGGPPS4,通过农杆菌介导法进行遗传转化。使用荧光定量PCR技术检测转基因烟株中NtGGPPS4的表达量,采用溶剂萃取法从转基因烟株中提取西柏三烯醇和质体色素,并分别使用GC-MS、LC-MS测定其含量。结果表明,在NtGGPPS4表达量明显下降的转基因烟株中,α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇、新黄质、紫黄质、β-胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b和叶黄素的含量明显下降。表明NtGGPPS4参与调控了烟叶中西柏三烯醇和质体色素的生物合成。     

低钾胁迫下钙调素拮抗剂对烟草幼苗钾积累的影响

为探讨低钾胁迫下钙调素（CaM）拮抗剂对植株幼苗钾积累的影响及其生理机制,采用室内水培法,以烟草品种K326为试验材料,设置2个钾水平和2种钙调素拮抗剂（氯丙嗪和三氟拉嗪）处理,分别测定叶片钙离子及钙调素含量、植株各部位钾含量、根系钾离子吸收相关基因的相对表达量、植株生理特征。结果表明,与常钾水平相比,低钾胁迫下植株各部位钾含量、叶片抗氧化酶活性、叶绿素含量及光合特性指标（除水汽压饱和亏外）明显降低。其中,植株地上部及根系钾含量分别显著降低了23.80%和55.50%,根系中NKT2、NtKC1和NtHAK1基因的相对表达量分别增加了4.05、2.98和12.74倍。2个钾水平下,施加钙调素拮抗剂后,植株各部位钾含量、抗氧化酶活性、叶绿素含量及光合特性6项指标（除水汽压饱和亏外）明显降低。低钾胁迫下,与未添加钙调素拮抗剂相比,钙调素拮抗剂处理的叶片钙调素含量、植株各部位钾含量、根系钾吸收相关基因表达量、叶绿素总含量及光合特性6项指标（除水汽压饱和亏外）显著降低,其中植株地上部及根系钾含量平均降低了23.69%和60.00%,根系中NKT2、NtKC1和NtHAK1基因的相对表达量平均降低了82.84%、94.18%和52.44%。低钾胁迫下添加钙调素拮抗剂会抑制钙调素含量,阻碍Ca²⁺-CaM复合体的形成,影响信号传导,导致叶片抗氧化酶活性及光合作用降低,根系中K⁺吸收相关基因的表达量减少,抑制植株K⁺吸收和积累。     

典型烤烟品种腺毛形态及分泌特性比较分析

为探讨烤烟叶面化学特征及其形成机制,本文以K326、红花大金元、中烟100、翠碧1号、豫烟11等代表性烤烟品种为试验材料,采用超景深显微技术、GC-MS分析检测技术和荧光定量PCR技术,对叶面腺毛形态、叶面化学成分以及腺毛分泌物合成关键基因表达进行了比较分析。结果发现:（1）烤烟腺毛由长柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛和非分泌保护毛等不同类型组成,翠碧1号和豫烟11中分泌型腺毛含量较高,而中烟100中非分泌型腺毛相对丰富。（2）西柏烷类化合物是烤烟叶面的主要化学成分,以K326中的含量为最高;赖百当类化合物在烤烟中含量极少,但豫烟11中顺冷杉醇和赖百当二醇含量较高。（3）西柏烷类合成酶关键基因CYC和CYP71D16在K326中表达活跃,赖百当合成酶关键基因CPS2在豫烟11中的表达量明显高于其它品种。不同烤烟品种之间叶面腺毛形态、基因表达及分泌物含量所存在的明显差异,可能与品种特色密切相关。      

香叶醇及其糖苷在茶树中的积累和对红茶香气的贡献

采用液相质谱联用仪LC-MS、气相质谱联用仪GC-MS分析不同茶树品种、不同组织器官、不同时间香叶醇及其糖苷含量的变化,结果显示:香叶基樱草糖苷在中国变种(Camellia sinensis var. sinensis)中的含量显著高于阿萨姆变种(C.sinensis var. assamica)。香叶基樱草糖苷在茶树幼嫩叶片中含量最高,在根中的含量最低,总体表现出嫩叶>茎>花>根。3月份茶树嫩梢中的香叶醇积累量最高,随着月份的增加而逐渐降低。在祁门红茶加工过程中,香叶基樱草糖苷含量在揉捻阶段显著降低。黄山地区6个品种红茶中,皖茶4号红茶中的香叶醇含量最高;6个品种红茶茶汤中香叶醇的气味活性值(OAV)均>1,分布范围3.93～28.38。Pearson相关性分析显示,有7个萜类合成酶候选基因表达量与香叶基樱草糖苷含量变化呈显著相关。本研究结果为进一步探究香叶醇积累差异成因及形成机制提供理论参考。     

RNAi 靶向沉默opaque2基因对高粱醇溶蛋白含量的影响

为研究opaque2基因沉默对高粱醇溶蛋白含量的影响,采用RNAi技术构建opaque2基因抑制表达载体,利用农杆菌介导转化高粱幼胚,测定转基因植株籽粒中醇溶蛋白含量,SDSPAGE电泳检测醇溶蛋白带型,并使用透射电镜观察胚乳细胞中蛋白质体变化。结果表明,与野生型相比,5株转基因植株中4株籽粒的醇溶蛋白含量显著降低(P0.05);野生型和各转基因植株的醇溶蛋白SDS-PAGE电泳带型相同;野生型胚乳细胞中淀粉粒排列紧密,部分大淀粉粒融合成大块状,蛋白质体数量较多且有一些体积较大;而转基因植株淀粉粒排列疏松,细胞中存在多处孔隙,蛋白质体数量较少,体积较小。opaque2基因沉默引起胚乳细胞蛋白质体数量变少,体积变小,进而影响胚乳细胞内部结构和籽粒醇溶蛋白含量。     

编辑烤烟多酚氧化酶基因NtPPO8后的效应分析

【目的】探究NtPPO8基因在烟草中的功能以及对烟叶耐烤性和烤后烟质量的影响。【方法】以烤烟品种NC89为材料,利用CRISPR/Cas9技术对NtPPO8进行定向编辑,获得纯合突变植株,测定并分析原品种和突变体在叶龄60 d时的基因表达量和植物多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）活性差异,探究NtPPO8基因对烘烤过程中的PPO活性以及烤后烟的多酚物质含量的影响。【结果】（1）共获得6株T0代纯合突变体,突变均发生在靶位点上,为1个碱基的插入突变。（2）4个T1代编辑株系的NtPPO8表达水平显著下降,所有编辑株系的PPO活性显著下降。（3）T1代编辑株系烘烤过程中的PPO活性低于原品种,烤后中部叶总酚含量显著高于原品种。【结论】定向编辑NtPPO8基因后,降低了其在烟叶中的表达量,抑制了烟叶在烘烤过程中的PPO活性,有助于烤后烟多酚类物质的积累。     

野艾与家艾茎叶挥发油的GC-MS分析

采用水蒸气蒸馏法分别提取野艾与家艾茎、叶中的挥发油,用气相色谱-质谱法(GC/MS)对其挥发性成分进行分析,并分别比较家艾和野艾茎叶挥发油的化学成分的种类和含量差异。结果表明:艾蒿的茎叶挥发油中共分离出109种挥发性成分,野艾和家艾的茎叶中共有12种相同的挥发性成分,其中主要的挥发性成分是萜类化合物,家艾、野艾茎中萜类化合物含量分别为66.352%,51.473%,而家艾、野艾叶中萜类化合物含量约为74.336%,73.186%。通过主成分分析可知家艾和野艾茎叶的挥发性物质主要是植酮、金合欢烯、蒎烯、桉叶油醇、樟脑、石竹烯、香叶烯。     

烟草茄尼醇积累与萜类关键酶基因表达的相关性

为阐明萜类关键酶基因对烟草茄尼醇合成的影响,利用超高效液相色谱和实时定量荧光PCR,测定了茄尼醇含量差异显著的烟草品种红花大金元(含量高)和中烟90(含量低)6个发育时期根、茎、叶中茄尼醇含量以及萜类代谢关键酶基因的表达,并分析了其相关性。结果表明,红花大金元和中烟90 6个时期的茄尼醇含量均为叶茎根。在两品种中,萜类关键酶基因FPS、DXR、IPI、SPS、GGPPS从苗期至开花期表达量逐渐上升,在根中现蕾期表达量最高,在茎、叶中开花期最高,随后迅速下降。相关性分析表明,DXS、GGPPS与茄尼醇含量呈负相关,而FPS、DXR、SPS以及IPI基因的表达量与茄尼醇含量呈显著和极显著正相关,其在红花大金元中的高水平表达可能是造成两品种茄尼醇含量差异的主要原因。另外,根、茎中IPI基因与DXS、FPS、SPS基因的表达呈显著和极显著正相关;叶片中SPS与FPS、IPI基因的表达呈显著正相关,而与DXS基因的表达呈显著负相关,HMGR与IPI基因表达呈极显著正相关。这些基因可能通过协同作用共同调控茄尼醇的合成与积累。     

琼产艾纳香叶精油的抗氧化和抗菌活性

采用水蒸气蒸馏法收集琼产艾纳香叶精油,经过GC-MS分析,精油中45种化合物被定性检出,主要是单萜类(48.55%)和倍半萜类(39.91%),相对含量列前五位的组分分别是(-)-龙脑(28.45%)、石竹烯(22.98%)、樟脑(9.56%)、α-荜澄茄烯(8.32%)和β-蒎烯(4.32%)。经过DPPH自由基清除试验、β-胡萝卜素漂白试验和硫代巴比妥酸法试验发现精油具有较强的抗氧化活性。琼脂扩散法和琼脂稀释法证实精油对6种受试菌都有抑制活性,对金黄色葡萄球菌、假丝酵母和黄曲霉具有较好的抑制能力(MIC:625μg/mL),对大肠杆菌、李斯特氏菌和沙门氏菌也表现出了抑制能力(MIC:2 500μg/mL)。以上结果证实琼产艾纳香叶精油具有明显的抗氧化和抗菌活性,拥有成为食品和化妆品的天然抗氧化剂及抗菌剂的潜力。     

气相色谱-串联质谱检测新鲜烟叶中的萜类成分

为研究烟叶中的萜类成分含量(质量分数),采用选择反应监测模式,建立了同时测定新鲜烟叶中反,反-金合欢醇、α-植醇、顺冷杉醇、β-植醇、(1S,2E,4S,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇(α-CBD)、(1S,2E,4R,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇(β-CBD)、香紫苏醇、赖百当-13-烯-8,15-二醇、角鲨烯、2,3-环氧化鲨烯、双氢速甾醇、胆固醇、菜籽甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、β-谷甾醇、β-香树脂醇、α-香树脂醇、鹅去氧胆酸等21种萜类成分的气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)方法;并采用该方法对云南、河南、贵州等3个产区的成熟期新鲜烟叶样品进行了分析。结果表明:在线性范围内21种萜类成分的R2为0.999 0～0.999 8;方法检测限为12.7～308.7 ng·g~(-1),定量限为35.8～984.6 ng·g~(-1);日内、日间精密度(RSD)分别为0.19%～8.28%、1.02%～9.35%。不同产区烟叶中主要萜类成分α-CBD的含量高低顺序为云南(98.83μg·g~(-1))河南(57.04μg·g~(-1))贵州(38.61μg·g~(-1)),且3个产区之间存在显著性差异。贵州产区烟叶中萜类成分含量的分布较云南和河南产区烟叶差异更大,遵义种植的南江3号品种烟叶中萜类含量与其他3个品种差异明显。该方法前处理简单,分析的萜类物质覆盖面广,可用于批量烟叶样品的检测。     

人工microRNAs干扰At3A06基因增强了拟南芥对菌核病的敏感性

基于本研究室自主开发的油菜防御cDNA芯片分析结果,油菜基因Bn3A06受菌核病诱导后特异上调表达。序列比对发现,该基因与拟南芥基因At3A06高度同源,后者编码289个氨基酸,功能未知。本研究用花序浸染法将At3A06基因的人工微RNA（amiRNA）干扰载体（该载体包含一个除草剂草胺磷抗性基因）转化拟南芥。经草胺磷筛选获得3株T1代转基因植株,PCR检测均为阳性;荧光定量PCR检测表明,与野生型对照相比,3个转基因植株的At3A06基因的表达量均显著降低;对其T2代进行菌核病抗性鉴定,结果显示转基因株系对菌核病的敏感性均显著增强（P〈0.05）。推测At3A06基因可能参与了植物的防御反应,与植株对核盘菌抗性相关。     

不同产区香料烟香味成分含量比较

采用无水乙醚萃取、GC/MS联用方法对国内不同产区香料烟和进口的土耳其、泰国香料烟的香味成分进行了分析,共定性定量了48种香味物质.结果表明:不同产区、不同部位香料烟香味成分组成相同,含量差异较大;云南A1和A2级香料烟香味成分总量(除新植二烯和叶绿醇外)最高;土耳其香料烟中有机酸所占比例超过香味成分总量的60％,酯类物质也占有较高比例,但赖百当类物质的含量及所占比例很低;泰国,新疆香料烟主要香味成分是有机酸和赖百当类物质,但后者的含量和所占比例均低于前者;云南、浙江、湖北香料烟中主要香味成分分别是赖百当类、有机酸和西柏烷类,云南和湖北香料烟还具有较高比例的有机酸,浙江香料烟类胡萝卜素类的含量及所占比例与赖百当类、西柏烷类接近,但却是所有产区中最高的.     

无醇杨梅果酒发酵工艺优化及其品质分析

利用单因素结合正交试验优化无醇杨梅果酒的发酵工艺,得出适宜的发酵条件为:发酵温度28℃,加渣量70 g/L,通氧发酵时间4 h。将无醇杨梅果酒与杨梅汁的香气成分进行对比分析,结果表明:无醇杨梅果酒的主要香气成分是酯类(30.31%)、高级醇类(19.39%)和烯萜类(31.22%)化合物,其中酯类和高级醇类的相对含量分别增加了165.41%和42.47%,烯萜类相对含量仅下降了35.04%。无醇杨梅果酒的有机酸主要是柠檬酸和L-苹果酸,占9种有机酸总量的96.96%。该发酵工艺获得的无醇杨梅果酒酒精度低(0.5%vol),花色苷含量达到155.1 mg/L,色泽呈紫红色,风味浓郁,较大程度地保持了杨梅原果清香。     

超量表达NrCN烟草光合特征及烟叶化学成分分析

为明确TMV抗性基因NrCN对转基因烟草光合特性及烟叶化学成分的影响,在人工培养箱和温室条件下以含有P_(ubi.u4)::NrCN表达元件的T_2代转基因烟草植株为材料,分析了不同转基因烟草株系应答TMV感染时NrCN的表达量、转基因烟草化学成分含量(质量分数),以及烟草光合作用指标的差异。结果表明,转基因株系Q2对TMV抗性最强,表现为TMV感染后NrCN基因的表达量最高,叶片可形成明显的坏死斑,Q1株系次之。烟叶化学成分测定结果表明,Q2植株打顶前后总植物碱和总氮含量均显著(P0.05)低于其他两个转基因(Q1、Q3)和非转基因植株;而打顶前后Q2株系中氯离子积累较多。另外,打顶前非转基因植株的可溶性糖含量(14.82 mg·g~(-1))极显著(P0.01)低于转基因Q1株系(21.88 mg·g~(-1))和Q2株系(16.85 mg·g~(-1))。光合指标测定结果显示,NrCN基因的导入使转基因烟草的光合作用指标发生了不同程度改变,其中Q1株系在低光强(1 000μmol·m~(-2)·s~(-1))时其净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)等指标均显著提高。因此Q1株系可作为培育抗TMV烟草新种质的理想亲本材料。     

鼠尾草酸通过激活AMPK降低游离脂肪酸诱导的HepG2细胞脂肪积累

目的:探究鼠尾草酸对游离脂肪酸(free fatty acids,FFAs)诱导的Hep G2细胞脂肪积累的作用机制。方法:采用FFAs(油酸-棕榈酸浓度比2∶1)诱导建立HepG2细胞高脂模型,使用不同浓度的鼠尾草酸(15、20μmol/L)、FFAs(1mmol/L)、AMP依赖的蛋白激酶(adenosine5’-monophosphateactivatedproteinkinase,AMPK)抑制剂(2μmol/L)处理细胞24h后,通过测定细胞内脂肪含量、细胞活力、总胆固醇(totalcholesterol,TC)和甘油三酯(triglyceride,TG)含量,脂肪代谢相关基因的转录表达水平以及磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶的表达水平,研究鼠尾草酸的降脂作用机制。结果:15、20μmol/L的鼠尾草酸,1mmol/L的FFAs单独或共同处理细胞24h对细胞的活力没有显著性影响;与正常组相比FFAs处理细胞24h,油红O染色结果显示,FFAs能显著增加细胞内的脂肪含量;FFAs能增加细胞内TC、TG含量,增加脂肪合成相关基因的表达水平,降低脂肪分解相关基因的表达水平(P0.05)。油红O染色结果显示,与FFAs处理组相比,鼠尾草酸可以降低细胞内的脂肪含量;鼠尾草酸能显著降低TC、TG含量,显著下调脂肪合成相关基因的表达,且使脂肪氧化相关基因的表达水平呈上升趋势,并显著上调磷酸化AMPK的表达量(P0.05)。使用AMPK抑制剂共同处理细胞24h,对细胞的活力没有影响,但可明显逆转鼠尾草酸的降脂作用(P0.05)。结论:鼠尾草酸能通过调控脂肪相关基因的转录水平和AMPK磷酸化激酶的表达来改善FFAs诱导的HepG2细胞的脂肪积累。     

重组产番茄红素大肠杆菌工程菌株中异戊烯异构酶(IDI)基因的筛选

番茄红素是一类在食品、医药等领域具有广泛应用价值的萜类化合物。异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)是番茄红素合成途径中的关键酶,也是代谢工程改造的主要靶点。本研究为了系统比较不同来源IDI对重组大肠杆菌番茄红素(Lycopene)产量的影响,分别克隆了原核微生物、真核微生物、植物、古菌等多种来源的I型及II型异戊烯基焦磷酸异构酶(IDI)基因,在大肠杆菌E.coli中异源表达,在加强自身2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)代谢途径的背景下,通过优化多靶点组合及转化时间提高番茄红素的合成水平。结果表明酿酒酵母来源的I型IDI(Sc IDI)及枯草芽孢杆菌来源的II型IDI(Bs IDI)在经优化的背景下可以获得最高的番茄红素产量,产量分别达到9.96 mg/g DCW,8.78 mg/g DCW,番茄红素积累在转化8 h达到最高,最高能达到10.29 mg/g DCW。本研究最终确定了不同类型IDI发挥功能的条件,为后续番茄红素以及萜类化合物的代谢途径的改造提供依据。