链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原的合成及其多克隆抗体制备

本研究采用肟化法用羧甲基羟胺半盐酸盐对链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸(Tenuaconic acid,TA)进行衍生后引入连接臂,得到了半抗原TAO。通过活性酯法将半抗原TAO分别与牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)偶联制备得到免疫原TAO-BSA、与血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)偶联制备得到包被原TAO-KLH。经透析纯化后分别采用紫外光谱、红外光谱扫描法对合成的人工抗原进行初步鉴定,制备得到的人工抗原的偶联比分别为18.3:1、38.7:1。此人工抗原免疫Balb/c小鼠后获得的鼠源抗血清进一步验证了人工抗原合成成功,制备得到特异性识别TA的多克隆抗体。通过ELISA棋盘法确定了最佳包被原浓度以及最佳抗体稀释度并建立了TA间接竞争ELISA检测方法,其灵敏度以半抑制浓度IC50表示为335.55 ng/m L,最低检出限(LOD)为19.00 ng/m L,定量线性检测范围为200.00~1563.00 ng/m L。     

基于光谱法研究异细交链孢菌酮酸半抗原-抗体的相互作用

本文采用紫外可见光谱(UV-Vis)、荧光光谱和圆二色谱(CD)技术研究了异细交链孢菌酮酸单克隆抗体(Mc Ab)与其半抗原(Ite AH)之间的相互作用并用ELISA方法对荧光结果进行了验证。结果表明,ITe AH对Mc Ab有荧光猝灭作用,淬灭机理主要为静态猝灭且遵循非辐射能量转移理论。在298、310、318 K 3个温度下,ITe AH与Mc Ab的结合常数分别为1.9×106、1.6×106、1.4×106 L/mo L,结合位点数n≈1,结合距离r为3.35 nm,经ELISA测得的结合常数与荧光分析的结果较一致。由结合作用过程的热力学参数可知,两者之间以静电引力为主要作用力,不同p H下,由ELISA结果可推测其影响了ITe AH与抗体结合。同步荧光光谱显示ITe AH的加入并未使抗体的酪氨酸和色氨酸残基附近的微环境发生明显改变,两者的结合位点更倾向于酪氨酸残基,圆二色谱分析发现ITe AH与Mc Ab相互作用后,抗体的二级结构发生明显变化。     

小麦粉中细交链孢菌酮酸和腾毒素标准物质的研制

目的 研制小麦粉中细交链孢菌酮酸和腾毒素标准物质.方法 利用天然污染交链孢霉毒素的小麦样籽粒制备,按照规定的定值程序,形成符合国家相关要求的小麦粉中细交链孢菌酮酸和腾毒素标准物质.结果 研制成功2个不同浓度水平的小麦粉中细交链孢菌酮酸和腾毒素标准物质,并获批国家二级标准物质[标准号:GBW(E)100547和GBW(E...     

光照对交链孢毒素合成的调控

目的 明确光调控交链孢（Alternaria）产真菌毒素的作用。方法 在光/暗培养条件下,比较分析光照对2种交链孢菌株（ATCC 66981和Pear-3）的菌丝生长、孢子形成以及毒素合成的影响。结果 持续白光照射对交链孢菌丝生长影响不显著,而显著抑制其孢子形成。光照刺激交链孢菌ATCC 66981中交链孢酚（alternariol, AOH）、交链孢酚单甲醚（alternariol monomethyl ether, AME）和腾毒素（tentoxin, TEN）3种毒素的产生。菌株持续光照培养30天,AOH、AME和TEN毒素浓度分别为120、182和173 g/L;较之黑暗培养,分别增加了1.1、5.9和9.6倍。光照抑制交链孢菌Pear-3中细交链孢菌酮酸（tenuazonic acid, TeA）毒素的合成。菌株光照培养6天,TeA毒素浓度即已达142 g/L;而黑暗培养甚至高达325 g/L,毒素产率反而增加了1.3倍。结论 光照不影响交链孢菌丝生长,而对孢子形成影响显著;持续白光照射能够促进交链孢中AOH、AME和TEN毒素的产生,而抑制TeA毒素的产生。     

间接竞争化学发光酶联免疫分析法检测番茄酱和果汁中异细交链孢菌酮酸

针对番茄酱和果汁中链格孢霉菌毒素污染问题,建立异细交链孢菌酮酸(iso-tenuazonic acid,ITe A)间接竞争化学发光酶联免疫分析法。通过棋盘法和单因素试验确定最佳包被原质量浓度为15.6 ng/m L、抗体质量浓度为稀释96 000倍、缓冲体系pH 7.4、竞争反应时间和二抗反应时间分别为40 min和50 min。方法IC50为2.13 ng/m L,线性范围为0.50~9.12 ng/m L,检测限为0.10 ng/m L,与结构功能类似物交叉反应率均小于0.1%,样品添加回收率在78.60%~110.83%之间,变异系数均小于15%。本方法适用于样品中ITe A污染的特异性快速筛查。     

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸的研究进展

链格孢霉（Alternaria）是污染食品和饲料最普遍的真菌之一。细交链格孢菌酮酸（tenuazonic acid,TeA）是链格孢霉毒素中最为重要的一种,可广泛污染蔬菜、水果及谷物。本文综述TeA毒素的来源及污染情况、理化性质及其毒性、检测方法等,并就未来研究方向进行展望。     

γ射线对溶液中交链孢菌酮酸降解效果的研究

目的探讨γ射线辐射对溶液中交链孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)的降解效果,为辐射技术用于控制食品中的真菌毒素提供理论及实践依据。方法以TeA标准溶液确定高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测方法的线性关系、检测限、定量限和精密度;采用~(60)Coγ射线辐射降解溶液中的TeA,基于HPLC方法研究辐照剂量、初始浓度、溶剂组成和辐照剂量率对溶液中TeA的降解效果及其降解规律。结果当TeA标准溶液浓度在0.05~5μg/mL范围时,TeA浓度与液相色谱峰面积间线性方程为Y=110.46X+0.3044,决定系数为0.9999。方法的检测限为0.008μg/mL、定量限为0.02μg/mL,仪器精密度的相对标准偏差小于2%。辐照剂量、溶液中TeA的初始浓度、溶剂组成以及辐照剂量率均影响溶液中Te A的降解率。以纯甲醇为溶剂的TeA降解率远低于溶剂中含有水的TeA降解率。在低辐照剂量率处理条件下,溶液中TeA的降解效果明显高于高辐射剂量率中的降解效果。结论γ射线辐射对溶液中的TeA具有良好的降解效果,为后续去除复杂食品基质中的TeA污染提供了理论支撑。     

农产品及其制品中交链孢酚和交链孢酚单甲醚研究进展

交链孢菌(Alternaria spp.)是一类重要的植物病原体,能产生多种毒素,其中交链孢酚(alternariol,AOH)和交链孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether,AME)是目前从食物中检出的比较普遍和主要的2种交链孢毒素,可广泛污染蔬菜、水果及谷物等农产品及其制品。本文对AOH和AME的结构及理化性质、毒性、产生影响因素、生物及化学合成和污染现状等进行了综述,并对交链孢毒素限量标准的制定、快速检测方法等进行了展望。     

胶束电动毛细管色谱法分析3种交链孢毒素主成分含量

目的 建立胶束电动毛细管色谱法(micellar electrokinetic chromatographic, MEKC)测定3种交链孢毒素[交链孢酚(alternariol, AOH)、交链孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether, AME)和交链孢菌酮酸(tenuazonic acid, TeA)]主成分含量的新分析方法。方法 以未涂层熔融石英毛细管柱(50μm×30 cm, 20 cm, i.d.)为分离柱,分别以3种分离缓冲溶液[40 mmol/L Na_2B_4O_7-120 mmol/L十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)(含体积分数为5%的乙腈)、30mmol/LNa_2B_4O_7-40mmol/LSDS(含体积分数为30%的异丙醇)和60mmol/L Na_2B_4O_7-180 mmol/L脱氧胆酸钠]及2种样品缓冲溶液[8 mmol/L硼砂(含体积分数为57%的甲醇用于AOH和TeA)、8mmol/L硼砂(含体积分数为57%的异丙醇用于AME)]分析AOH、AME和TeA的主成分含量。结果 AOH、AME、TeA的方法精密度分别为0.05%、0.01%和0.21%(n=5),检出限分别为5、15和0.5 mg/L。主成分含量分别为99.94%、99.78%和97.28%,且与高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)的结果无显著差异(α=0.05)。结论 MEKC法可作为HPLC法测定3种交链孢毒素主成分含量方法的互补方法 ,能够满足3种交链孢菌毒素主成分含量分析的要求。     

臭氧处理对交链孢菌生长及其毒素积累的抑制作用

交链孢菌（Alternaria spp.）易侵染农作物,引起农产品病害,而且能够代谢产生交链孢毒素,包括细交链孢酮酸（tenuazonic acid,TeA）、交链孢酚（alternariol,AOH）、交链孢酚单甲醚（alternariol monomethyl ether,AME）等,严重影响人体健康。因此,亟需高效、安全的方法用以防控交链孢菌及其毒素积累。本实验研究了臭氧处理对体外互隔交链孢（A. alternata）生长及其产毒能力的影响。结果表明,臭氧处理组的菌落直径显著低于对照组（P＜0.05）,且臭氧处理可显著抑制互隔交链孢产生TeA、AOH、AME这3 种交链孢毒素;利用扫描电子显微镜观察臭氧处理后互隔交链孢的微观形态,发现孢子和菌丝发生了凹陷、褶皱、断裂等异常现象;臭氧处理后的交链孢菌对番茄果实的致病力明显减弱,同时交链孢菌的产毒能力明显降低,20 mg/L臭氧处理条件下TeA、AOH、AME含量比对照组分别减少了36.1%、89.9%、93.2%。此外,臭氧对TeA、AOH、AME具有降解作用,降解率随着臭氧质量浓度的增加和处理时间的延长而显著提高,TeA经过20 mg/L臭氧处理30 min即可被完全降解,AOH及AME经20 mg/L臭氧处理120 min后降解率可达90%以上。综上,臭氧处理可以作为农产品及其制品中互隔交链孢及其毒素污染的防治手段。     

4种邻苯二甲酸酯塑化剂人工抗原的合成及免疫检测

以4-硝基邻苯二甲酸为原料,衍生合成4 种结构类似物,并分别通过重氮化法和活泼酯法与载体蛋白牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）和卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）偶联制得人工抗原。利用紫外光谱扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroporesis,SDS-PAGE）检测鉴定人工抗原,并用4 种与BSA偶联的人工抗原作免疫原免疫新西兰大白兔。利用酶联免疫吸附实验（enzymelinkedimmunosorbent assay,ELISA）检测抗体灵敏度和特异性。经紫外光谱和SDS-PAGE证实人工抗原偶联成功,经免疫分析法检测抗体效价,4-氨基邻苯二甲酸二丁酯-BSA（dibutyl 4-aminophthalate-BSA,DBAP-BSA）抗体效价达到1∶64 000,4-戊二单酰邻苯二甲酸二丁酯-BSA（dibutyl 4-carboxylphthalte-BSA,DBCP-BSA）、4-氨基邻苯二甲酸二异丁酯-BSA（diisobutyl 4-aminophthalate-BSA,DiBAP-BSA）和4-氨基邻苯二甲酸二环己酯-BSA（dicyclohexyl 4-aminophthalate-BSA,DCHAP-BSA）抗体效价均达到1∶128 000。DBAP-BSA、DBCP-BSA、DiBAP-BSA和DCHAP-BSA分别对邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate,DBP）、DBP、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate,DiBP）和邻苯二甲酸二环己酯（dicyclohexyl phthalate,DCHP）4 种抗体的IC50值为0.305、0.268、0.104、0.247 μg/mL。四者之间交叉反应率低,反应特异性较好。     

甲胺磷衍生物的合成及人工抗原的制备

O,S-二甲基硫代磷酰氯与β-丙氨酸反应,得到一种甲胺磷的结构衍生物,经薄层层析和1HNMR鉴定,推测预期产物生成。分别采用活泼酯法和混合酸酐法将产物与BSA、OVA偶联制备了人工抗原MZB和MGO,通过紫外光谱鉴定证明偶联成功。用TNBS比色法测定了MZB、MGO与载体蛋白的克分子结合比,分别为16:1和9:1。以MZB为免疫原免疫Balb/c小鼠,以MGO为包被抗原对小鼠血清进行间接竞争ELISA分析表明,小鼠经免疫后产生了针对甲胺磷的特异性抗体,抗血清效价为51:200,从而进一步证明抗原合成成功。本方法简便易行,为研究建立甲胺磷的免疫分析方法奠定了基础。     

1-芘丁酸人工抗原的制备及鉴定

为制备及鉴定1-芘丁酸（1-pyrenebutyric acid）人工抗原。采用碳化二亚胺（EDC）法将1-芘丁酸与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清白蛋白（OVA）进行偶联,合成人工免疫原PBA-BSA和人工检测抗原PBA-OVA;紫外扫描及SDS-聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示抗原制备成功;鼠源多抗血清的效价均已超过1 000,IC₅₀=14.31 ng/mL;与多环芳烃1-芘甲醇、1-芘甲醛、芘的交叉反应率小于14.40%,与菲、萘、苯并芘、BSA以及OVA交叉反应率均小于0.05%。作者成功制备出了PBA-BSA抗原,并且得到了敏感性良好的鼠源多抗血清,为后期单克隆抗体的制备及免疫学快速检测方法的建立奠定基础。     

胭脂红酸人工抗原合成及多克隆抗体的制备

为了快速高效检测食品中胭脂红酸含量,本研究通过羟基二咪唑法制备了胭脂红酸人工抗原;通过免疫新西兰大耳白兔获得了胭脂红酸抗血清,经硫酸铵沉淀法分离纯化获得抗胭脂红酸多克隆抗体;利用棋盘滴定法检测了抗体效价,并探究了溶液pH值、离子强度和有机溶剂对ELISA反应的影响,优化出最佳ELISA反应条件;在最佳反应条件下,建立了胭脂红酸的间接竞争ELISA抑制曲线。紫外光谱扫描结果显示,免疫抗原(CA-BSA)和检测抗原(CA-OVA)均与载体蛋白成功偶联;经分离纯化获得的胭脂红酸多克隆抗体效价为1:16000;检测抗原最佳浓度为1μg/m L、ELISA反应最适缓冲液为pH7.4、含50mmol/L Na~+且无甲醇的磷酸盐缓冲液;间接竞争ELISA标准曲线的线性范围为7.8～1150ng/mL,检测限为1ng/mL,灵敏度IC_(50)值为95.2ng/mL。本研究为开发CA快速检测试剂盒对食品中胭脂红酸含量的大量快速测定奠定了基础。     

环丙沙星人工抗原的合成及鉴定

通过化学方法制备了环丙沙星的免疫抗原和包被抗原;分别采用碳二亚胺(EDC)法和氯甲酸乙丁酯法把环丙沙星与BSA进行了偶联制备了人工免疫抗原CIP-BSA,EDC法制备了包被抗原CIP-OVA,经PAGE、紫外分光光度法测定了人工合成抗原的偶联比,EDC法和氟甲酸乙丁酯法制得的CIP-BSA两分子结合比率分别为4:1和11:1,CIP-OVA中两分子结合比率为12:1.这为环丙沙星单克隆抗体的制备奠定了基础.     

丁草胺人工抗原及抗体制备研究

以除草剂丁草胺、巯基丙酸为原料,合成丁草胺半抗原,用氢核磁共振、电喷雾质谱、红外光谱方法进行鉴定;通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备丁草胺人工抗原,用紫外光谱法对其鉴定;免疫动物后,间接竞争ELISA检测鉴定抗体。结果表明,巯基丙酸与丁草胺连接生成半抗原,半抗原被连接到载体蛋白上,丁草胺人工抗原合成成功,获得了丁草胺小鼠抗血清。棋盘滴定法确定包被抗原工作浓度为3μg/ml,抗血清稀释倍数为32000倍。建立了间接竞争ELISA标准曲线,丁草胺IC50为1.44μg/ml,检测限为0.47μg/ml。     

庆大霉素人工抗原及多克隆抗体的制备与鉴定

为研究建立庆大霉素的免疫分析技术,合成庆大霉素人工抗原:采用碳二亚胺法将庆大霉素(gentamicin,GM)偶联到牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)上,分别合成免疫原GM-BSA和包被原GM-OVA。通过紫外扫描和SDS-PAGE垂直电泳鉴定证明人工抗原偶联成功。以GM-BSA为免疫原,采用新的动物免疫方案免疫新西兰大白兔,获得抗庆大霉素抗血清。在本次免疫新方案中,在动物的生命周期内获得了多于普通免疫的血清量,在多抗血清的制备上是一次抗体工程上的尝试。通过间接酶联免疫对抗血清效价和灵敏度进行跟踪检测,结果表明抗血清效价在九免后稳定在1:20000左右,IC50则稳定在3 ng/mL左右。并在八免血清基础上建立了GM间接竞争ELISA法。结果表明,庆大霉素浓度在0.3~243 ng/mL,方法的线性回归方程为y=-0.1009lnx+0.6093和R2=0.9845,方法的检测灵敏度IC50=2.954 ng/mL,最低检测限IC10=0.056 ng/mL。该研究结果为多抗血清制备在量上的突破提供了思路,同时为研制庆大霉素试剂盒提供了良好的基础。