流式分析技术快速定量检测牛乳中大肠杆菌O157:H7

建立一种基于流式分析技术的快速定量检测牛乳中大肠杆菌O157:H7的方法。用偶联有异硫氰酸荧光素的大肠杆菌O157单克隆抗体对大肠杆菌O157:H7进行特异性标记,通过优化抗体反应条件,建立流式检测方法,然后对磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline,PBS）和人工污染牛乳样品中不同浓度的大肠杆菌O157:H7进行定量检测。本研究建立的流式检测方法的在PBS中的检测范围为2.57×103～1.12×108?CFU/mL,灵敏度达到2.57×103?CFU/mL。将所建立的流式检测方法应用于牛乳样品检测,当人工污染牛乳样品中大肠杆菌O157:H7的浓度在2.31×104～1.48×108?CFU/mL之间时,流式检测方法与平板计数方法检测结果基本一致,方法的灵敏度为2.31×104?CFU/mL,检测时间为35?min。该方法能快速、定量地检测出牛乳样品中的大肠杆菌O157:H7,在食源性致病菌的快速筛查和监控中具有重要的应用价值。     

出血性大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体制备及免疫胶体金试纸条的研制

将骨髓瘤细胞SP2/0与出血性大肠杆菌O157∶H7免疫小鼠得到的脾细胞融合,通过筛选得到3株稳定分泌抗出血性大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株D3、E7、B9,D3和B9亚类为IgG1,E7亚类为IgG2a,轻链亚型均为κ。交叉反应结果显示这3株单抗仅结合出血性大肠杆菌O157∶H7,对15株其他细菌无反应,测得胶体金标记单抗最佳pH、最佳结合量分别为D3:pH 7.5⁸.0、24μg/mL;B9:pH 7.5、12μg/mL;E7∶pH7.5、18μg/mL,抗体配对选择胶体金结合D3喷涂金标垫、E7以1 mg/mL喷涂NC膜作T线为最优组合,试纸条检测出血性大肠杆菌O157∶H7灵敏度为2.1×106CFU/mL,且仅可检出出血性大肠杆菌O157∶H7,对25株其他细菌均无交叉反应,模拟带菌实验表明,对市售面包、牛奶、果冻各25 g(mL)均添加约200 CFU出血性大肠杆菌O157∶H7,增菌培养8、10、10 h即可检出。研究表明,实验自主制备的抗体性能良好,试纸条特异性、灵敏度达到国外同类产品,可在政府食源性致病菌监管部门、食品企业推广运用。     

大肠杆菌O157:H7特异基因的实时荧光定量PCR检测

为建立快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chainreaction,RT-PCR)方法,针对大肠杆菌O157:H7的特异基因rfbE设计一对特异引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行灵敏度、重复性和特异性实验,同时与常规PCR方法进行比较。结果显示所建立的SYBRGreenⅠ实时定量PCR方法可以快速、特异地检测出大肠杆菌O157:H7,细菌纯培养物中其灵敏度可达2×101CFU/mL,临床模拟污染肉样中能最低能检测到1×102CFU/mL的大肠杆菌O157:H7。与常规PCR方法相比,SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法对临床样品中大肠杆菌O157:H7的检出率大大提高。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术能快速准确、特异、敏感地检测大肠杆菌O157:H7。     

利用光纤倏逝波生物传感器检测食品中大肠杆菌O157:H7

目的建立一种应用光纤倏逝波生物传感器快速检测食品中大肠杆菌O157:H7的方法。方法对光纤用大肠杆菌O157:H7抗体包被制备检测探针,用纳米量子点对抗体进行偶联制备检测抗体,并确定其检测的灵敏度和特异性,同时通过对人工污染样品的检测确认该方法检测实际样本的可行性。结果建立的光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度达到50 CFU/mL,并具有较强的特异性。结论利用光纤倏逝波生物传感器检测食品中污染的大肠杆菌O157:H7方法快速、准确,具有较强应用价值。     

利用光纤倏逝波生物传感器检测食品中 大肠杆菌O157:H7

目的 建立一种应用光纤倏逝波生物传感器快速检测食品中大肠杆菌O157:H7的方法。方法 对光纤用大肠杆菌O157:H7抗体包被制备检测探针,用纳米量子点对抗体进行偶联制备检测抗体,并确定其检测的灵敏度和特异性,同时通过对人工污染样品的检测确认该方法检测实际样本的可行性。结果 建立的光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度达到50 CFU/mL,并具有较强的特异性。结论 利用光纤倏逝波生物传感器检测食品中污染的大肠杆菌O157:H7方法快速、准确,具有较强应用价值。     

多重PCR快速检测两种致泻性大肠杆菌方法的建立

本研究以肠出血性大肠杆菌O157∶H7及肠侵袭性大肠杆菌为目标菌,针对大肠杆菌共同基因uid A、肠出血性大肠杆菌O157∶H7的特异基因O-antigen、肠侵袭性大肠杆菌的特异基因ipa H设计3对引物,建立并优化了检测两种菌的多重PCR检测方法,进行了特异性验证和灵敏度分析,并应用于人工接种新鲜莴苣的检测中。实验结果表明,本研究建立的三重PCR快速检测两种致病菌的检出限为6.3×103CFU/m L,具有较好的灵敏度和特异性。利用所建立的多重PCR方法对人工接种肠出血性大肠杆菌O157∶H7和肠侵袭性大肠杆菌的新鲜莴苣进行检测,检出限为7.8×104CFU/m L。此方法能够对肠出血性大肠杆菌O157∶H7和肠侵袭性大肠杆菌两种食源性致病菌进行快速检测。     

大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条的研制

采用胶体金标记抗大肠杆菌O157:H7 单克隆抗体(鼠源),通过将大肠杆菌O157:H7 多克隆抗体和驴抗鼠抗体(二抗)喷涂于硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,研制大肠杆菌O157:H7 胶体金快速检测试纸条。通过优化实验,确定最佳条件为标记量16.8μg/mL、标记pH8.0、封闭剂PEG20000、检测时样品最佳pH7.0～7.5。对26 株常见细菌交叉反应结果表明,该试纸条除与鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311 和金黄色葡萄球菌CMCC 26003 有轻微交叉反应外,与其他24 株菌均无交叉反应。该试纸条灵敏度为104CFU/mL。用该试纸条检测大肠杆菌O157:H7操作简便、快捷、灵敏度高、特异性强。     

双抗夹心ELISA检测食品中大肠杆菌O157:H7方法研究

研究获得纯化抗大肠杆菌O157:H7IgY抗体,经检测10mg/ml纯化IgY抗体的效价为1:320;以大肠杆菌O157:H7免疫新西兰大耳白兔,获得兔抗大肠杆菌O157:H7IgG抗体,效价达1:25600。以兔抗大肠杆菌O157:H7IgG抗体稀释3200倍作为捕获抗体,抗大肠杆菌O157:H7IgY抗体为检测抗体建立双抗夹心ELISA方法检测大肠杆菌O157:H7,正交试验分析表明,捕获抗体于37℃包被2h、不封闭、抗原与捕获抗体于37℃结合2h、检测抗体浓度为0.25mg/ml、与抗原于37℃结合1h为最优反应条件。该方法对纯培养菌液检出限为105CFU/ml,具有良好的敏感性及特异性。染菌样品经在EC增菌液中选择性培养后进行双抗夹心ELISA检测,接种量为0.1～1CFU/g(ml)的样品在培养12h后可检出阳性反应,1～10CFU/g(ml)的样品在培养8h后可检出阳性反应。     

IMSA技术快速检测肠出血大肠杆菌O157:H7方法的建立及应用

为了建立和评价一种适合食药监及基层检验部门使用的肠出血性大肠杆菌O157:H7快速检测方法,针对肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性rfbE 基因,应用等温多自配引发扩增技术（Isothermal Multiple Self-matching-initiated Amplification,IMSA）,设计引物进行检测。对建立的方法进行特异性试验和灵敏度试验,与荧光定量PCR法进行比对;利用建立的IMSA法确定人工污染样本被检出的最短增菌时间和最低检测灵敏度;使用IMSA法和国标法对24份不同肉制品进行检验,评估两者的一致性。结果表明:该方法仅对肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性扩增;IMSA法的灵敏度比qPCR法高,达8.9×102 CFU/mL;人工污染菌种样本最短增菌10 h可以被建立的IMSA法检出,检出限为9.1 CFU/25 g;24份肉制品样本的IMSA法与常规培养法结果一致性为100%。结论: IMSA技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7具有特异性强、灵敏度高、结果快速准确的特点,可在11 h内完成食品中O157:H7的检出,适用于食药监及基层检验部门进行肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测。     

使用环介导等温扩增技术快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的初步研究

目的探索建立一种快速、简单的食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的检测方法。方法针对编码O157∶H7脂多糖的rfbE基因(GenBank S83460)和编码H7鞭毛抗原的fliC基因(GenBank L07388)特征性保守序列,利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)核酸扩增基因技术,对21株O157∶H7和非O157∶H7菌株进行特异性检测,并与聚合酶链式反应方法进行比较。同时使用部分食品样品对LAMP法检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的实际运用价值进行评估。结果LAMP法可以在1h内完成检测工作。LAMP法检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的灵敏度为96.72%,特异度为85.71%,准确性为93.26%。结论LAMP检测技术的灵敏度较聚合酶链式反应技术高。LAMP是一种简单、快速的检测技术,适用于筛选可疑大肠杆菌O157∶H7样本。     

不同粒径纳米金标记二抗增强表面等离子共振检测E. coli O157:H7

基于双通道表面等离子共振（surface plasmon resonance,SPR）传感器,结合不同粒径的金纳米粒子（Aunanoparticle,AuNPs）标记多克隆抗体（polyclonal antibody,PAb）作为第二抗体,采用氨基偶联的方法将PAb固定在传感器表面作为第一抗体,采用三明治夹心法进行了检测大肠杆菌O157∶H7（E. coli O157∶H7）的研究。考察3 种粒径的AuNPs作为标记物,增强SPR响应信号检测E. coli O157∶H7的能力。结果表明,增强效果最佳的AuNPs粒径为17.79 nm,其可检测到的E. coli O157∶H7的最低浓度为10 CFU/mL。     

基于钴金属有机骨架材料（ZIF-67）催化性能的牛奶中大肠杆菌O157:H7快速定量检测

建立一种基于金属有机骨架催化性能的快速定量检测牛奶中大肠杆菌O157:H7的方法。以2-甲基咪唑和CoCl2?6H2O为原料,Bola型两亲性表面活性剂为溶剂合成一种钴金属有机骨架材料（ZIF-67）。对ZIF-67的催化性能进行研究,发现ZIF-67具有和辣根过氧化物酶类似的催化活性,并能在无过氧化氢存在的情况下催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺显色。基于此建立一种通过磁性微球进行特异性富集,通过检测与靶标结合的ZIF-67的量间接检测牛奶中大肠杆菌O157:H7的方法,该方法的检测范围为17～1.7×108?CFU/mL,检测限为17?CFU/mL,检测过程在1?h以内。该方法能快速、简单、高灵敏度、高选择性定量地检测出牛奶中的大肠杆菌O157:H7,在食源性致病菌的快速筛查中具有重要的应用价值。     

基于内参的大肠埃希氏菌O157∶H7实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

针对大肠埃希氏菌O157∶H7 rfbE和Flic靶基因保守序列,设计特异性引物和探针,优化反应体系,并加入内参（internal amplification control,IAC）,建立能够实时监控反应过程的荧光定量聚合酶链式反应（polymeasechain reaction,PCR）检测方法。结果表明,该方法对E. coli O157∶H7基因组DNA的最低检测限为1 pg/μL;对含有靶基因质粒的最低检测限为103 copies/μL;对细菌的最低检测限为5×103 CFM/mL;Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系（R2=0.999）。人工污染实验结果表明,在初始菌量为7 CFM/25 g时,采用水洗加试剂盒法提取DNA,E. coli O157∶H7在增菌6 h后即可检出;而采用水煮法提取DNA,则在增菌10 h后方可检出。建立的E. coli O157∶H7实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中O157∶H7,又能实时监测PCR反应过程,有效防止“假阴性”的发生。     

免疫磁分离法高效富集牛奶中大肠杆菌O157:H7

目的建立一种免疫磁分离(immunomagnetic separation,IMS)方法高效富集大肠杆菌O157:H7。方法合成一种核壳型的纳米磁珠(magnetic nanobeads, MNBs),并基于制备的MNBs构建了IMS。通过优化制备免疫MNBs时抗体浓度, IMS过程免疫MNBs的用量和孵育时间,构建了高效的IMS方法。结果构建的IMS方法能够在35 min内完成牛奶中大肠杆菌O157:H7的高效富集,当大肠杆菌O157:H7浓度低于10~5 CFU/m L时,捕获效率高于93.4%,当菌浓度达到10~7CFU/mL,捕获效率仍大于50%。结论该方法简单高效,可被广泛应用于其他食源性致病菌检测的样品前处理。     

基于SiO2荧光纳米粒子快速检测果汁中 大肠杆菌的免疫传感器研究

目的设计一种基于SiO_2荧光纳米粒子快速检测果汁中大肠杆菌O157:H7的新型传感器。方法采用超分子组合法将荧光基团嵌入到SiO_2纳米颗粒中合成SiO_2荧光纳米粒子,然后将抗大肠杆菌O157:H7的单抗偶联到纳米粒子表面,最后通过抗原-抗体反应使纳米粒子与待检细菌结合,使用荧光显微镜观察并统计大肠杆菌O157:H7的个数。结果本方法与革兰氏染色法相比,对大肠杆菌O157:H7计数结果无统计学差异(P=0.930);该方法整个检测过程能够在15 min内完成,检测下限小于10 CFU/mL。结论该方法能增强检测果汁中大肠杆菌O157:H7的灵敏度,缩短检测时间,对其他病原体检测方法的改进具有重要的指导意义。     

应用DPO-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

利用双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide,DPO）聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7。根据DPO引物设计原则,以肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE 基因为靶基因设计一对DPO引物,经过反应体系的优化,建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7 DPO-PCR检测方法, 其检测灵敏度约为94 CFU/mL。与常规PCR方法相比,所建立的DPO-PCR方法对退火温度不敏感,在引物设计和实 验过程中不需要对引物及其退火温度反复优化,同时基于DPO引物的特殊结构又增强了其特异性。DPO-PCR方法 设计简易、特异性强,为致病性微生物的快速准确检测提供了新途径。     

基于噬菌体特异性的新型荧光酶联方法检测食品中大肠埃希菌O157∶H7

目的对一种基于噬菌体特异性的检测食品中大肠埃希菌O157∶H7的新型荧光酶联方法(VIDASECPT)进行了评价。方法利用VIDASECPT、VIDASECO、BAXO157三种快速方法检测不同浓度大肠埃希菌O157∶H7标准菌株的生理盐水悬浮液,并对VIDASECPT和常规培养法检测食品中大肠埃希菌O157∶H7进行了比对。结果 VIDASECPT检测大肠埃希菌O157∶H7的检出限为104 CFU/ml,并且不受大肠埃希菌背景菌的干扰,其他两种快速方法的检出限均为105 CFU/ml,其中VIDASECO易受到背景菌的干扰;检测不同食品基质中大肠埃希菌O157∶H7,当大肠埃希菌O157∶H7的浓度为104 CFU/ml时,VIDASECPT与常规培养法无统计学差异。结论 VIDASECPT方法检测大肠埃希菌O157∶H7具有快速、灵敏、抗干扰性强的特点。