加压二氧化碳对大肠杆菌的存活影响及其致死效果

加压二氧化碳对E.coli有明显的致死作用,按照致死速率的快慢,整个过程可分为两个阶段：缓慢死亡期和迅速死亡期.CO₂进入水相和细胞的速率控制着缓慢死亡期的持续时间和致死速率.提高压力和温度有利于提高加压CO₂对E.coli的致死效果.较低的初始环境pH可以加快E.coli在加压CO₂下的死亡.考察了搅拌和泄压方式对加压二氧化碳使E.coli致死效果的影响,结果表明改善二氧化碳的传质速率是提高致死效果的关键.不同菌龄的细胞对加压二氧化碳的敏感程度不同,对数生长期的细胞更易致死.     

Recent Advances in Prion Inactivation by Plasma Sterilizer

Prions, which cause transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), are a notorious group of infectious agents with possibly the highest resistance to complete inactivation. Although various gas plasma instruments have been developed, studies on prion inactivation using gas plasma instruments are limited. Among them, the hydrogen peroxide gas plasma instrument, STERRAD^® (Advanced Sterilization Products; ASP, Johnson & Johnson, Irvine, CA, USA), is recommended for prion inactivation of heat-sensitive medical devices. However, STERRAD^® is not a plasma sterilizer but a hydrogen peroxide gas sterilizer. In STERRAD^®, plasma generated by radio frequency (RF) discharge removes excess hydrogen peroxide gas and does not contribute to sterilization. This is also supported by evidence that the instrument was not affected by the presence or absence of RF gas plasma. However, recent studies have shown that other gas plasma instruments derived from air, nitrogen, oxygen, Ar, and a mixture of gases using corona, dielectric barrier, microwave, and pulse discharges can inactivate scrapie prions. As inactivation studies on prions other than scrapie are limited, further accumulation of evidence on the effectiveness of gas plasma using human-derived prion samples is warranted for practical purposes.     

大肠杆菌L- 天冬酰胺酶的分离纯化及其特性

目的 建立简单有效的L- 天冬酰胺酶分离纯化工艺，研究L-天冬酰胺酶的特性。方法 采用冷丙酮破壁处理，经稀碱液抽提、离子交换层析和亲和层析进行纯化。通过温度试验、pH试验、SDS－PAGE图谱、紫外吸收光谱等研究酶的特性。结果 建立了简单高效的纯化工艺，可使L-天冬酰胺酶的纯度达94．4％，比活为520u/mg蛋白，总收率为65．7％。L-天冬酰胺酶的相对分子质量分别为143900和166700，均为有抗癌活性的EC－2组分，在270nm有最大吸收。最适作用温度为40－50℃，最适作用州为8.0-9.0在40℃以下能保持稳定。结论建立了大肠杆菌L-天冬酰胺酶的分离纯化工艺，并研究了L-天冬酰胺酶的酶学特性。     

Peracetic acid‐enhanced photocatalytic and sonophotocatalytic inactivation of E. coli in aqueous suspensions

BACKGROUND: Although chlorination is an effective and widely employed method of water disinfection, it suffers serious drawbacks such as the formation of toxic chlorinated by‐products. Therefore, other disinfection technologies have been researched and developed, including advanced oxidation. RESULTS: The efficacy of heterogeneous photocatalysis and sonophotocatalysis induced by UV‐A irradiation and low frequency (24–80 kHz) ultrasound irradiation in the presence of TiO₂ as the photocatalyst and peracetic acid (PAA) as an additional disinfectant to inactivate E. coli in sterile water was evaluated. PAA‐assisted UV‐A/TiO₂ photocatalysis generally leads to nearly complete E. coli inactivation in 10–20 min of contact time with the extent of inactivation depending on the photocatalyst type and loading (in the range 100–500 mg L^?1) and PAA concentration (in the range 0.5–2 mg L^?1). The simultaneous application of ultrasound and UV‐A irradiation in the presence of TiO₂ and PAA prompted further E. coli inactivation. CONCLUSIONS: The proposed advanced disinfection technology offers complete E. coli inactivation at short treatment times and low PAA doses. Copyright © 2010 Society of Chemical Industry     

木瓜凝乳蛋白酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的构建木瓜凝乳蛋白酶(CP)的表达载体,并在大肠杆菌中表达。方法从生番木瓜中提取mRNA后进行反转录,得到木瓜凝乳蛋白酶的cDNA,PCR产物克隆到pET22-b(+)载体中,重组质粒转化至大肠杆菌BL21,进行诱导表达及表达产物的检测。结果表达产物的SDS-PAGE显示单一条带,相对分子质量约为26000。Western blot表明表达产物可与抗木瓜凝乳蛋白酶特异性抗体结合。结论CP基因已成功在大肠杆菌中克隆表达,为进一步纯化和动物实验奠定了基础。     

大肠杆菌肉碱脱水酶基因的克隆、测序及高效表达

［摘 要］目的 克隆并表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因。方法 用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB，测定其DNA序列，将caiB基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET－28a（＋）中，构建表达质粒pETCaiB，转化大肠杆菌BL21（DE3），用1mmol/L异两基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果 克隆得到的肉碱脱水酶编码基因 caiB长度为 1221bp，与文献报道值相比,DNA序列有26个不同，氨基酸序列只有一个不同，即302位的丙氨酸变为苏氨酸。重组菌经IPTG诱导，可高效表达，SDS－PAGE分析表达蛋白相对分子质量约43000，表达产物含量占菌体总蛋白45％以上。结论 得到了高效表达肉碱脱水酶的重组菌，为制备L-肉碱创造了条件。     

耐药大肠杆菌的致病性与免疫原性

目的了解大肠杆菌耐药株的致病性与免疫原性。方法临床分离耐药大肠杆菌,经适宜条件培养后接种小鼠,观察耐药菌株对小鼠的致病性;并选择已知血清型的不同耐药谱和不同耐药水平的菌,分别培养至对数生长期,经甲醛灭活后免疫小鼠,2周后分别用致死剂量的原菌株和同期分离菌株进行攻毒,考察耐药菌株免疫原性。结果24株耐药菌普通肉汤培养物分别感染小鼠,在接种后18h,存活率仅为4%。只有2株菌在1周内仍不能将小鼠全部致死,经小鼠体内传3代后,可在18h内致死小鼠。耐药谱广的菌株感染的小鼠,心肌发生颗粒变性、局灶性出血、坏死;肝脏糖元溶解,脂肪变性;脾脏轻度淤血,淋巴细胞减少;肾脏出血,肾小球肾炎,上皮细胞颗粒变性,水泡变性。而耐药种类少的菌株与对照敏感菌株感染的小鼠主要特征为脾脏出血、淤血,坏死,脾小体消失;肠上皮细胞坏死、脱落、卡他性肠炎。免疫小鼠以免疫用菌株攻毒,均可得较高的保护率,最低为75%,最高为100%。免疫小鼠用非免疫菌株攻毒,小鼠感染后症状出现较缓慢,在18h后出现死亡高峰。耐药种类少的菌株免疫小鼠,对同期分离的非免疫用的致病性大肠杆菌攻击的保护率偏低,而对受试的11种抗生素耐受7种以上的菌株免疫小鼠后,对致病大肠杆菌攻击的保护率显著提高,多数达到75%以上,经统计学分析差异显著。结论耐药大肠杆菌具有较强致病性,且耐药特性与其免疫保护效果相关,多重耐药株对当前流行菌株具有更好的免疫保护作用。     

抗菌肽Dermaseptin S4及其突变体基因在大肠杆菌中的表达

目的构建表达抗菌肽Dermaseptin S4(DS4)及其突变体K4-S4的工程菌,并表达目的蛋白。方法采用重叠延伸PCR法设计和扩增抗菌肽DS4及K4-S4基因,定向克隆入载体pUC-18中,经酶切、测序鉴定,重组至表达载体pGEX-4T-1中,构建抗菌肽DS4及K4-S4基因表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS,经IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE鉴定。结果构建的抗菌肽DS4及K4-S4基因工程菌所表达的目的蛋白,经SDS-PAGE鉴定可见相对分子质量34 000的特异性目的条带,37℃诱导5 h的蛋白表达量最高,且多数以包涵体形式存在。结论已成功构建抗菌肽DS4及K4-S4工程菌,并表达目的蛋白,为进一步研究其功能和应用奠定了基础。     

Dynamic control of arabinose and xylose utilization in E. coli

The common bacterium Escherichia coli (E. coli) can utilize the pentose sugars arabinose and xylose for growth and energy. When fed both these sugars, the bacterium preferentially utilizes arabinose and only when all the arabinose is exhausted from the media does it start to use xylose. This hierarchical utilization of the two sugars is dictated by two proteins: AraC and XylR. These proteins act as controllers of sugar utilization and dictate the timing and rate of utilization of these sugars. While the biochemical interactions defining individual arabinose and xylose utilization systems are well understood, it is not completely understood how the hierarchical utilization is maintained by the bacterium, and how the regulatory crosstalk between the two systems facilitates this hierarchy. To help answer these questions, in this work, we systematically experimentally characterize the regulatory crosstalk between the two sugar utilization systems. Our work demonstrates extensive interaction between the two sugar systems. Specifically, data from our experiments suggest that the xylose system can regulate arabinose gene expression and consequently, cellular physiology dynamically via promiscuous transport and maybe through cross interactions between regulator and non‐cognate sugar. Put together, we demonstrate that arabinose and xylose utilization networks exhibit an example of distributed control in a biological system. This design likely ensures that the system does not fail under perturbations (mutations). Our results help understand multi‐process control in biological systems and bring to light design criteria for synthetic biology applications.

     

人Leptin基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆Leptin基因,构建其重组表达菌株,并对表达产物进行免疫学鉴定。方法利用RT-PCR方法从脂肪细胞RNA中扩增出人瘦素前体(pre-Leptin)的cDNA片段和去信号肽序列的Leptin成熟基因片段,并插入pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达重组人瘦素(rh-Leptin)的菌株。结果DNA序列分析显示获得的pre-Leptin和成熟基因片段的序列与预计序列一致,菌株诱导后经SDS-PAGE检测,rh-Leptin表达量达菌体总蛋白的40%以上。Western blot分析显示重组Lep-tin具有免疫学活性。结论已获得高效表达Leptin的重组菌株。     

等离子体-催化剂体系下甲苯加氢反应

探索了等离子体介质阻挡放电甲苯加氢工艺的行为。反应产物的气相色谱分析结果表明甲基环己烷为主产物。单因素实验法考察不同因素对甲苯加氢反应行为的影响,初步推测等离子体环境下甲苯加氢反应包含三种机理:加成反应、取代反应、C-C键断裂反应。研究发现,通过增大放电功率和催化剂(Ni/SiO2)协同作用,可使甲基环己烷转化率趋于最佳值。在反应条件为:"一段式"催化剂装填方式,0.30 g催化剂固载于0.1 g玻璃纤维上,催化剂活性金属组分含量17%(wt);放电电压8.4 k V;电极直径50 mm;气体配比(VH2/VC7H8)31;停留时间21 s,其甲苯转化率可达78.4%,甲基环己烷选择性72.2%。     

HIV-1型衣壳蛋白P24在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

用聚合酶链式反应 (PCR)从 HIV - 1gag基因序列中扩增出衣壳蛋白 (P2 4)基因 ,插入表达载体p GEX- 4T3中 ,构成重组质粒 p GEX- p2 4,在大肠杆菌 BL 2 1中高效表达出重组 P2 4。经 Glutathione- Sepharose4B亲和层析纯化后 ,重组 P2 4在间接 EL ISA和免疫印迹中表现出很高的抗原特异性和免疫反应性。     

大肠杆菌丙酮酸脱氢酶的克隆与表达优化

为了在大肠杆菌中表达大肠杆菌丙酮酸脱氢酶,用PCR法从大肠杆菌总DNA中克隆了pdc基因,将其插入载体pGEX-KG后转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下实现了表达.通过对表达条件的优化,在TB M9(1∶1)培养基中,33℃下使用终浓度0.5 g·L-1的乳糖诱导4 h,重组大肠杆菌丙酮酸脱氢酶的表达量可占全菌蛋白的45%左右,比未优化前提高了约20%,同时大大降低了成本.     

人重组酸性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的表达及鉴定

利用逆转录-DNA聚合酶链式反应，从体外传代培养的人肺成纤维细胞中钓出人酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）全编码区的cDNA，将其克隆人pKK223-质粒，在大肠杆菌JM105中高效表达出人重组aFGF。此aFGF经Heparin－Sepharose纯化后，表现了很好的生物学活性。     

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。     

SiO2/TiO2薄膜对水中腐殖酸降解及大肠杆菌灭活效果的研究

采用溶胶-凝胶法制备了SiO2/TiO2粉体并采用XRD、TG-DTA及Uv-vis对其结构进行了表征.采用热沉积法将其负载于玻璃板上,以水中天然有机物腐殖酸和典型菌种大肠杆菌为代表物考察了SiO2/TiO2薄膜的光催化活性,并对其机理进行了推测.研究结果表明,SiO2/TiO2薄膜具有较高的光催化活性及抑菌作用.硅的引入不仅使催化剂的带隙变宽,提高了催化剂表面上光生e-h+的氧化还原能力,而且使催化剂表面出现了更多有利于光生空穴-电子转变为·OH的吸附氧,这是SiO2/TiO2薄膜使水中污染物降解及细菌灭活的主要原因.     

乳源抗高血压活性肽CEI_(12)在大肠杆菌中的表达

目的在大肠杆菌中表达乳源抗高血压活性肽CEI12。方法将人工合成血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)的DNA序列CEI12连接到表达载体pQE16上,转化到JM109中,筛选出重组子,在E.coliBL21中表达,用Westernblot检测表达结果,并且比较了不同温度的表达水平。结果乳源抗血压活性肽CEI12在E.coliBL21中的表达量约为1·2mg/L培养液,在25℃诱导的表达量高于37℃的表达量。结论已成功在大肠杆菌BL21中表达了乳源抗高血压活性肽CEI12。     

人类免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白(Gag)在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白Gag,为HIV感染的诊断和疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增获得HIV1gag基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX5X1的tac启动子下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westernblot分析验证其表达产物。结果表达产物是相对分子质量为82000的GST融合蛋白,且能与抗p24单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Gag蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达,且具有良好的抗原性,可进一步用于HIV感染及动物免疫等方面的研究。     

检测牛血清中污染大肠杆菌噬菌体方法的建立

用大肠杆菌标准噬菌体株选择确定的大肠杆菌44451和44369作为宿主菌，建立了检测牛血清污染大肠杆菌噬菌体的直接噬菌斑法和增殖法。此法操作简便、灵敏度高。     

重组降血压肽在大肠杆菌中的高效表达

目的获得具有高活性的重组降血压多肽。方法人工合成高活性降血压肽单体,经酶切位点串联,克隆至表达载体,并转化宿主菌BL21进行诱导表达。结果经酶切、PCR和测序均证明,串联的基因ACEIP已成功克隆至pGEX-4T-2表达载体中,融合蛋白GST-ACEIP的表达水平达24·6%,表达产物的融合蛋白和多肽含量分别为1·1g/L和0·14g/L,其抑制活性达85%。结论已成功制备出高活性的重组降血压多肽,为进一步开发降血压药物奠定基础。