人源大麻素Ⅰ型受体基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建人源大麻素Ⅰ型受体(human cannabinoid receptor 1,hCBⅠ)基因GV230真核表达质粒,并于HEK-293细胞中进行表达。方法以人脑皮质细胞的总RNA为模板,扩增获得hCBⅠ基因,克隆至真核表达载体GV230,构建重组表达质粒GV230-hCBⅠ,筛选阳性克隆,脂质体瞬时转染HEK293细胞。置倒置荧光显微镜下观察,并采用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)和Western blot法检测hCBⅠ基因在HEK293细胞中的表达。结果重组表达质粒GV230-hCBⅠ经双酶切及测序鉴定,构建正确。转染48 h后,转染率约40%,CBⅠ蛋白主要于细胞膜分布及表达,且于相对分子质量约50 000处可见特异性条带。结论成功构建了重组真核表达质粒GV230-hCBⅠ,并于HEK293细胞中表达,为进一步研究CBⅠ的生物学功能奠定了基础。     

不同组织脂联素受体的表达与代谢性疾病的研究进展

脂联素是脂肪细胞分泌的重要的脂肪因子,对代谢的调节有着重要的作用。脂联素受体是近年的研究的热点。脂联素受体的分布存在差异,提示其调节机制存在不同,对不同组织表达调控的研究,有助于进一步了解各种疾病发生发展过程,有可能有针对性地对脂肪分布、能量代谢、胰岛素敏感性和动脉粥样硬化进行干预和调控,有着重要的临床意义。     

吲哚类大麻素受体选择性激动剂共同特征药效团模型的研究

大麻素受体与疼痛、炎症、骨质疏松等多种疾病紧密相关,是极具潜力的药物靶点。本研究分别选取吲哚类CB2选择性激动剂和CB1选择性激动剂为研究对象,采用Discovery studio 2019软件分别构建两种激动剂共同特征药效团模型,首次对这两种药效团模型进行比较分析。随后通过测试集和ROC曲线两种验证方法对CB2选择性激动剂药效团模型的可靠性进行验证和筛选,得到一个最佳模型,该模型可用于天然化合物数据库的筛选,为发现新型CB2选择性激动剂提供理论基础。     

激活素A及其ⅡA型受体在ConA诱导小鼠急性肝损伤时的表达及其作用

目的探讨激活素A(ActivinA)及其ⅡA型受体(ActRⅡA)在刀豆蛋白A(ConA)诱导小鼠急性肝损伤时的表达及其作用。方法尾静脉注射ConA诱导小鼠急性肝损伤,测定血清转氨酶水平判断肝脏组织损伤程度,实时定量RT-PCR检测ActivinA及ActRⅡAmRNA转录水平;应用抗ActivinA和ActRⅡA抗体进行阻断试验,测定血清转氨酶水平,HE染色观察肝组织病理学变化。结果ConA诱导的急性肝损伤模型小鼠血清转氨酶水平明显升高,ActivinA及ActRⅡAmRNA转录水平也明显高于对照组;体内应用抗ActivinA和ActRⅡA抗体阻断ActivinA和ActRⅡA的作用,均可不同程度减轻肝损伤。结论ActivinA是介导ConA诱导小鼠急性肝损伤的重要致病因子,阻断ActivinA的表达或其作用途径,可能成为治疗肝损伤疾病的有效靶点。     

血管紧张素Ⅱ2型受体基因多态性与山东济宁地区汉族女性原发性高血压的相关性

目的研究血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因A1675G多态性与山东济宁地区汉族女性原发性高血压(EH)的相关性。方法随机选取山东省济宁地区汉族女性EH患者127例(EH组)和体检正常的女性119例(正常对照组),提取外周血基因组DNA,PCR扩增A1675G基因,高分辨率熔解(HRM)法测定A1675G基因的多态性。结果EH组AA、AG和GG基因型频率(分别为26.8%、53.5%和19.7%)与正常对照组(分别为27.7%、42.0%和30.3%)比较,差异均无统计学意义;等位基因频率(A:53.5%;G:46.5%)与正常对照组(A:48.7%;G:51.3%)比较,差异也无统计学意义。结论A1675G基因多态性可能与山东省济宁地区汉族女性原发性高血压无明显相关性。     

代谢型谷氨酸受体4胞内段的原核表达及纯化

目的原核表达代谢型谷氨酸受体4胞内段(metabolic glutamate receptor 4 intracellular,GRM4 intracellular,GRM4 intra),并用Ni柱进行纯化。方法采用PAS(PCR-based accurate synthesis)法合成GRM4 intra基因序列,将目的片段和质粒p Czn1双酶切后,经连接,构建重组质粒pCzn1-GRM4 intra;将重组质粒转化至Rosseta菌株,IPTG诱导GRM4 intra蛋白的表达,表达的蛋白利用Ni柱亲和层析法纯化。结果经测序和双酶切鉴定证明质粒pCzn1-GRM4 intra构建正确;在IPTG诱导下,质粒能够在Rosseta菌株中高效表达,表达的蛋白相对分子质量约18 400,主要以可溶性性形式存在,纯度> 90%。结论成功获得了原核表达的GRM4 intra蛋白,为利用体外pull down方法鉴定GRM4的相互作用蛋白提供了参考。     

基于CRISPR/Cas9系统Ⅰ型干扰素受体亚单位1基因敲除的Caco-2细胞系的构建

目的 利用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palinmic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)系统在人结肠腺癌细胞Caco-2中敲除Ⅰ型干扰素受体亚单位1(interferon alpha/beta receptor subunit 1,IFNAR1)基因,构建IFNAR1基因敲除Caco-2细胞系。方法 利用CRISPR/Cas9技术设计特异性识别IFNAR1基因外显子区的sgRNA(single guide RNA)序列,构建LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA重组质粒,慢病毒包装后感染Caco-2细胞,嘌呤霉素抗性筛选,有限稀释法培养单克隆细胞系。通过靶基因测序和Western blot法验证IFNAR1基因敲除情况;通过加入外源性IFNβ检测IFNAR1基因敲除细胞CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand 10,CXCL10)和干扰素刺激基因20(interferon-stimul...     

肠道病毒71型感染患儿外周血自然杀伤细胞比例、亚群、表面受体及免疫效应分子的变化

目的探讨肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)感染患儿外周血中自然杀伤(Natural killer,NK)细胞比例、亚群、表面受体及免疫效应分子的变化。方法将EV71阳性的急性期患儿按疾病严重程度分为重症病例组和普通病例组,同时设健康对照组。提取各组患儿外周血,采用流式细胞术检测外周血中NK细胞比例、NK细胞亚群、自然细胞毒受体NKp30和NKp46、激活性受体NKG2D、抑制性受体CD94和NKG2A、脱颗粒标记CD107a及免疫效应分子(PF、GrB和GNLY)阳性细胞所占NK细胞的比例。结果重症病例组患儿外周血NK细胞比例较健康对照组明显减少(P<0.01),普通病例组CD16+NK细胞亚群比例较健康对照组升高(P<0.05),重症病例组较普通病例组低,但差异无统计学意义(P>0.05);重症病例组和普通病例组NKG2D阳性细胞百分率均较健康对照组低(P<0.01),而CD94和NKG2A阳性细胞百分率均较健康对照组明显升高(P<0.01),NKp30和NKp46阳性细胞率3组之间差异无统计学意义(P>0.05);重症病例组和普通病例组CD107a、PF、GrB、GNLY的阳性细胞百分率均较健康对照组明显降低(P<0.01或P<0.05)。结论 EV71感染可能抑制宿主NK细胞的增殖、激活及其杀伤功能。重症病例组与普通病例组比较,NK细胞比例和CD16+NK细胞亚群降低,抑制性受体CD94表达增高,胞浆内CD107a、GrB和PF表达显著降低,可能与重症病例的发生有关。