一株祁连山野生毛头鬼伞菌的分离鉴定及其生物学特性分析

目的对一株祁连山大型野生食用菌进行分离鉴定,并分析其生物学特性。方法经组织分离获得野生菌株QL-8,提取其基因组DNA,以其为模板扩增内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)片段,并进行测序及系统发育分析。采用单因素试验方法检测温度(18、20、22、24、26、28℃)、p H值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、碳源(蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘露醇、甘油、葡萄糖)、氮源(硝酸钾、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、尿素)、无机盐(硫酸铁、硫酸钙、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、硫酸镁)、维生素(VB1、VB2、VB3、VB6、VB12、VB复合)对菌丝生长的影响。使用不同栽培料(棉籽壳、木屑、粪草)对野生菌进行栽培试验。结果菌株QL-8属于毛头鬼伞属,Gen Bank登录号为KF702392。菌丝生长的最适温度为24~26℃,最适p H为7.0,最适碳、氮源分别为蔗糖和酵母粉,添加一定量的硫酸镁和VB6有助于菌丝的生长。该菌株于木屑培养料中生长最快,满袋后覆土即可出菇。结论成功获得了菌株QL-8的生长特性和出菇条件,并培育出野生毛头鬼伞子实体,为天然野生菌实现人工栽培提供了实验依据。     

一株副溶血性弧菌裂解性噬菌体的分离、鉴定及其生物学特性

目的从贝类样品中分离一株副溶血性弧菌裂解性噬菌体,并对其进行鉴定及生物学特性分析。方法采用双层平板法从贝类样品中分离副溶血性弧菌噬菌体,观察噬菌斑特征;利用聚乙二醇8000浓缩噬菌体颗粒,Cs Cl等密度梯度离心纯化;采用透射电镜观察磷钨酸负染的噬菌体大小和形态,酚-氯仿法提取噬菌体核酸,通过限制性核酸内切酶处理分析其核酸类型;常规方法分析噬菌体的热稳定性、最适培养温度、最适盐浓度、p H稳定性及对氯仿、乙醚的敏感性,并测定噬菌体最佳感染复数(MOI),绘制一步生长曲线。结果分离获得了一株副溶血性弧菌裂解性噬菌体,命名为Vp JYP1;其噬菌斑中心透明区域直径为1.5~2.5 mm,外有晕圈,直径为8~11 mm;透射电镜观察显示,其头部呈二十面体立体结构,直径约60 nm,尾部宽约8 nm,长约20 nm,按国际病毒分类委员会分类标准,其符合短尾病毒科(Podoviridae)特征;Vp JYP1核酸为双链DNA;生物学特性分析显示,Vp JYP1在40~60℃稳定,最佳培养温度为36℃,最适盐浓度为3%~4%,在p H 5~11稳定,对氯仿、乙醚均不敏感,最佳MOI为0.001,感染宿主菌的潜伏期约为5 min,裂解期约为45 min,裂解量约为110。结论分离得到的Vp JYP1属于短尾病毒科裂解性噬菌体,具有副溶血性弧菌生物抑菌剂的应用潜力。     

人呼吸道合胞病毒适应株筛选及其生物学特性

目的建立在Vero细胞上低温传代的人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)适应株,并分析其生物学特性。方法从155份肺炎儿童痰样中经PCR、测序鉴定出14株RSV,将其在Vero细胞上37℃传代第1次收获的病毒记为野毒株(wild-type,WT),通过逐步降低培养温度的方法在Vero细胞传代获得1株适应株(adapted-strain,AS)KM516-AS。将RSV适应株感染A549细胞后,分别至37、25、32和39℃培养,测定其冷适应性和温度敏感性。分别将RSV适应株及其对应的野毒株KM516-WT经鼻腔免疫小鼠,于免疫后第8天,取肺组织制作病理切片,显微镜下观察病变程度;取鼻甲和右肺匀浆组织,制备上、下呼吸道匀浆液,测定上、下呼吸道病毒滴度;于免疫后第13天,经小鼠尾部静脉采血,分离血清,于免疫后第14天,取肺组织制备匀浆液,采用ELISA法测定总抗体滴度,病毒中和试验法测定中和抗体滴度。结果 RSV野毒株KM516-WT的适应温度范围较广,4个不同温度下的病毒滴度变化不大;RSV适应株KM516-AS的适应温度范围较窄,25℃时的病毒滴度最高,随着温度的升高,病毒滴度逐渐降低,且仅有温度敏感性而无冷适应性。野毒株组小鼠肺部呈暗褐色,无严重的实质化,且肺泡和毛细血管中有明显的淋巴浸润;适应株组小鼠肺泡和毛细血管中淋巴浸润较少。适应株在体内的复制水平低于野毒株,并同野毒株一样具有较好的免疫原性。结论获得1株RSV适应株,并具有一定的减毒效果。     

肠道病毒71型Lanzhou01株的分离及其生物学特性

目的对肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)Lanzhou01株进行分离、鉴定,并分析其生物学特性,为EV71疫苗候选毒株的筛选奠定基础。方法从兰州市手足口病患者的粪便样本中分离EV71,经蚀斑克隆传代后,RT-PCR法检测其特异性;Vero细胞甲基纤维素蚀斑法分析病毒的毒力;克隆病毒的VP1基因,进行序列测定及分析;扫描电镜观察病毒的形态;以不同的MOI接种Vero细胞,观察细胞病变,并绘制病毒的增殖曲线;连续传代,分析VP1基因和氨基酸序列,并测定毒力,检测其遗传稳定性。结果经细胞传代和蚀斑克隆,获得增殖性能稳定的分离株,RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析可见约250bp的特异性条带;经VP1基因测序与进化树鉴定为EV71,其与浙江、深圳等地的EV71分离株的核苷酸序列同源性均大于99%,属于C4基因亚型;电镜下观察病毒颗粒为球形,直径20～30nm;该病毒在Vero细胞上培养后产生典型的细胞病变,毒力为6.8LgPFU/ml;经Vero细胞连续传30代,不同代次的病毒VP1基因序列的核苷酸序列同源性大于或等于99.6%,氨基酸序列几乎没有明显变异,毒力也无明显改变。结论已成功分离1株EV71,其生物学特性良好,为灭活疫苗的研制及疫苗候选株的筛选奠定了基础。     

尖锐湿疣患者角质形成细胞的培养及其生物学特性鉴定

目的 对尖锐湿疣(condyloma acuminatum,CA)患者皮损处角质形成细胞进行培养及鉴定,测定β-catenin m RNA表达情况,分析细胞周期的变化。方法 采用两步消化法对皮损细胞进行消化,获得原代角质形成细胞后,进行体外无血清培养基培养。镜下观察细胞形态,并进行免疫组化染色鉴定;绘制细胞生长曲线;MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞仪测定细胞周期。结果 镜下可见细胞为多角形或不规则形,呈铺路石状,细胞生长旺盛,轮廓清晰,折光性好,胞浆均被染成红色,为角蛋白阳性,于第3天开始进入对数生长期,第7、8天进入平台期。获得的角质形成细胞可稳定增殖,在CA的发病过程中,β-catenin m RNA的表达异常,细胞周期发生改变。结论 CA的发病过程中β-catenin m RNA的表达异常及细胞周期的改变可为CA的临床治疗提供了理论依据。     

抗树鼩CD4单克隆抗体的制备及其生物学特性的鉴定

目的制备鼠抗树鼩CD4单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法将重组质粒p GEX-5X-1-CD4和pET30a(+)-CD4分别转化感受态E. coli BL21和BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并通过Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱纯化重组蛋白GST-CD4和His-CD4。以His-CD4蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术筛选出能分泌抗树鼩CD4的杂交瘤细胞株,制备小鼠腹水单克隆抗体,间接ELISA法检测效价,并通过Protein A亲和层析柱纯化获得鼠抗树鼩CD4单克隆抗体,Western blot及FACS法分析其生物学特性。结果筛选出3株能稳定分泌抗树鼩CD4单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为37D2、38E1、39F2,腹水单克隆抗体效价分别为1∶204 800、1∶204 800、1∶3 200。经HRP标记的38E1单克隆抗体可与树鼩PBMC总蛋白发生特异性结合,经PECy5. 5标记的38E1单克隆抗体能特异性识别树鼩PBMC。结论成功制备了鼠抗树鼩CD4的单克隆抗体,为进一步对树鼩作为动物模型的研究及应用奠定了基础。     

成年SPF鸡胃肠道中芽胞杆菌的分离与部分生物学特性鉴定

目的　鉴定从SPF鸡分离出的芽胞杆菌的生物学特性。方法　从成年SPF鸡胃肠道的不同部位选择性分离 13株芽胞杆菌 ,并进行生物学特性检测。结果　 ( 1)所有菌株均能在含 5 %、10 %和 15 %NaCl的LB平板上生长 ,其中 11株能在含 6 %NaCl的LB平板上生长 ,7株能在含 7%NaCl的LB平板上生长。 ( 2 ) 2株能在pH 4 0的LB平板上生长 ,8株菌能在pH 5 0生长 ;所有菌株均能在pH 6 0～ 10生长 ,其中 12株能在pH 11生长 ,11株能在pH 12生长 ,而不能在pH 13～ 14生长。 ( 3)所有菌株在 75℃水浴中均能活存 2～ 5h ;11株能活存 10h ,9株能活存2 7h。所有菌株在 10 0℃水浴中加温 ,均能活存 0 5～ 2h ,其中 11株能活存长达 3h。 ( 4 )所有菌株在pH 4 0和pH11 0的LB培养基中均能存活半年以上 ,在pH 2 0和 13 0环境中能存活 1周和 3周以上。 ( 5 )菌体以沸石粉做载体常温保存 ,1年之内含量基本不变。 ( 6 )所有菌株均具有蜡样芽胞杆菌的特性。 ( 7)所有菌株对链霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素、庆大霉素、红霉素均敏感 ,对青霉素、土霉素和黄胺药均有抗性。结论　所有菌株均有望成为制备微生态制剂的候选菌株。     

一种肠道病毒71型毒株的一般生物学特性检测及分子鉴定

目的对一种肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)毒株进行一般生物学特性检测及分子鉴定。方法将EV71毒株接种于人横纹肌瘤(rhabdomyosarcoma,RD)细胞进行病毒培养,通过EV71致细胞病变效应(CPE)分析、CCID50法检测子代病毒产量、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测EV71核酸合成情况以及免疫荧光印迹检测EV71蛋白表达水平,来确认其生物学特性;RT-PCR扩增EV71保守区的基因片段后进行基因测序,并将测序结果经BLAST程序进行同源性比对。结果该毒株接种RD细胞48 h后出现明显的CPE,其可在RD细胞中增殖,最终导致细胞死亡;该毒株在RD细胞中处于快速复制状态,其核酸合成与蛋白表达随时间的延长大量增加;该毒株与EV71/wuhan/3018/2010(KF501389)的核苷酸序列同源性为100%。结论该EV71毒株为EV71/wuhan/3018/2010,在RD细胞中可快速增殖,毒力较强,适合作为抗EV71药物筛选毒株。     

轮状病毒基因重配株LD_9(G_2型)Vero细胞适应株的选育及其生物学特性

目的探讨轮状病毒基因重配株LD(9G2型)在Vero细胞上的传代适应性,选育高滴度的适应株。方法将3个轮状病毒基因重配株LD9克隆株(G2型)(LD9-1、LD9-2、LD9-3)在Vero细胞上分别以0.05、0.10、0.15和0.20MOI传代,选育出1株Vero细胞适应株,并确定其最适MOI,然后在Vero细胞上连续传代15代,检测病毒滴度及基因组核酸带型,采用nestRT-PCR法扩增其VP7基因。取第8、10、13代适应株病毒,以0.10MOI接种于Vero细胞,观察病毒的增殖动态。结果选育出的LD9-2株以0.10MOI接种Vero细胞可产生明显的细胞病变(CPE),病毒滴度随传代次数的增加先下降后升高,至4代时最低,9代后稳定于6.75lgCCID50/ml左右;连续传代15次,病毒基因组核酸带型均与原始毒株一致,且均能扩增出502bp的VP7基因。LD9-2株病毒增殖高峰期均出现在第7～8天,病毒滴度为6.00～7.00lgCCID50/ml。结论轮状病毒基因重配株LD9株(G2型)经Vero细胞适应性培养,获得了病毒表达量高且能稳定传代的疫苗候选株。     

人二倍体细胞(2BS株)细胞库的建立及生物学特性鉴定

目的建立人二倍体细胞(2BS株)主细胞库和工作细胞库。方法将人二倍体细胞(2BS株)扩大培养后冻存,建立主细胞库和工作细胞库,采用台盼蓝染色计数细胞,计算细胞活力,并进行染色体、外源病毒因子、微生物污染、致瘤性的检测及鉴别试验。将全面检定合格的工作细胞库细胞分别接种至T75一次性培养瓶、3 L玻璃转瓶和10层细胞工厂,观察细胞形态;将水痘病毒分别按0.010 5、0.012 8、0.018 8 MOI接种至T75一次性培养瓶、3 L玻璃转瓶和10层细胞工厂上的单层细胞,收获病毒原液,检测病毒滴度。结果主细胞库细胞活力为94.1%,工作细胞库细胞活力为94.4%;1 000个处于分裂相时期的细胞的核型分析结果均在《中国药典》三部(2010版)人二倍体细胞染色体分析标准的规定范围内;细胞上清液和裂解液中人外源病毒因子检测结果均为阴性,符合《中国药典》三部(2010版)规程要求;细胞均贴壁,成纤维细胞形态,种属鉴别为人细胞B型;细胞库未被细菌、真菌、病毒及支原体污染,也未出现致瘤性。建立的细胞库在3种培养器皿中均可在工艺要求时间内生长为单层,单位面积活细胞浓度在(2.01~2.59)×105个/cm2之间,收获的病毒滴度在5.0~5.25 lg PFU/ml之间,符合成都生物制品研究所有限责任公司《水痘减毒活疫苗制造及检定规程》要求。结论建立了人二倍体细胞(2BS株)主细胞库和工作细胞库,为2BS细胞应用于水痘减毒活疫苗的研发和生产提供细胞资源和理论依据。     

一株短程反硝化除磷菌的鉴定与生物学利用

依据短程反硝化除磷原理,在SBR装置中加入厌氧池污泥,采用厌氧/缺氧工艺,投入亚硝酸盐以富集短程反硝化除磷菌（SDPB）,并进行SDPB的筛选、分离,采用传统与现代分子生物学鉴定相结合手段确定其分类地位,同时进行不同营养条件和环境条件下菌的生物学利用研究。结果表明：该菌株为一株新的兼性厌氧菌株,具有同步短程反硝化和除磷功能。通过细菌形态、生理生化指标、培养特征和16S rDNA序列进行同源性比较,鉴定该菌株为不动杆菌属,相似性高达99.3%,该种尚未见文献报道。Gi菌的最佳碳源为乙酸钠。此菌不仅可以利用NO^-₂也可以利用NO^-₃为电子受体。Gi菌的最佳pH值为7。温度为25℃时的反硝化除磷效果最好,适宜的温度为20～35℃。当温度为10℃时微生物生长受到抑制,温度高于35℃时活性下降。磷、氮的最高去除率分别可达82.94%和82.99%。     

高产乳酸细菌发酵厨余垃圾生产乳酸的试验研究

应用从厨余垃圾中分离到的一株乳杆菌TD175作为接种菌株,强化厨余垃圾的乳酸发酵.在不控制pH值条件下厌氧发酵2d,菌株TD175可以得到9.20g/L的乳酸,比不接种的对照实验乳酸浓度高88%.菌株TD175发酵厨余垃圾的最适接种量为15%.采用原料不灭菌的开放式发酵比原料灭菌后再发酵更有利于提高乳酸产量.     

一株对苯二甲酸降解菌的鉴定及其降解特性

从扬子石油化工责任有限公司废水处理装置的污泥池中分离、筛选得到了一株高效降解对苯二甲酸（PTA）的菌株，PA-18.采用PCR扩增获得该菌16SrDNA片段，核苷酸序列分析结果表明：该菌株的16SrDNA的核苷酸序列与多株假单胞菌（Pseudomonas sp.）的同源性为99%，在细菌系统发育分类学上，该菌株属于假单胞属.在温度为37℃、pH 7.0、OD_{660 nm}2.0条件下，反应24 h，此菌对PTA的降解率大于95 %.同时对于实际的PTA废水也有很好的处理效果，COD_Cr去除率高达85%.在好氧降解作用下，PTA降解的主要中间物被确定为原儿茶酸.     

Biocomposites of poly(lactic acid) and lactic acid oligomer-grafted bacterial cellulose: It's preparation and characterization

This work demonstrates the synthesis of lactic acid oligomer-grafted-untreated bacterial cellulose (OLLA-g-BC) by in situ condensation polymerization which increased compatibilization between hydrophobic poly(lactic acid) (PLA) and hydrophilic BC, thus enhancing various properties of PLA-based bionanocomposites, indispensable for stringent food-packaging applications. During the synthesis of OLLA-g-BC, hydrophilic BC is converted into hydrophobic due to structural grafting of OLLA chains with BC molecules. Subsequently, bionanocomposites films are fabricated using solution casting technique and characterized for structural, thermal, mechanical, optical, and gas-barrier properties. Morphological images showed uniform dispersion of BC nanospheres in the PLA matrix, which shows strong filler–matrix interaction. The degradation temperatures for bionanocomposites films were above PLA processing temperature indicating that bionanocomposite processing can be industrially viable. Bionanocomposites films displayed decrease in glass transition (T_g) and ~20% improvement in elongation with 10 wt % fillers indicating towards plasticization of PLA. PLA/OLLA-g-BC films showed a slight reduction in optical transparency but had excellent UV-blocking characteristics. Moreover, dispersed BC act as blocking agents within PLA matrix, reducing the diffusion through the bionanocomposite films which showed ~40% improvement in water-vapor barrier by 5 wt % filler addition, which is significant. The reduced T_g, improved elongation combined with improved hydrophobicity and water-vapor barrier make them suitable candidate for flexible food-packaging applications. © 2019 Wiley Periodicals, Inc. J. Appl. Polym. Sci. 2019 , 136, 47903.     

用乳酸细菌从有机废弃物生产乳酸

探讨了有机废物乳酸发酵的影响因素,包括菌种、营养物质、产物抑制、氧气和发酵方式,概述了利用含碳水化合物的有机废弃物和厨房垃圾生产乳酸的现状,并对未来的研究方向提出了展望。指出在厌氧条件下应用同型发酵乳酸细菌,采用原位产物分离技术和细胞再循环发酵通常会提高乳酸的产量;采取多菌种的联合发酵并优化提取工艺,将有助于实现有机废物工业化生产乳酸。     

Production of optically pure poly(lactic acid) from lactic acid

Optically pure poly(lactic acid) (PLA) was obtained from lactic acid via purification of the corresponding lactide. The optical purity of PLA was determined using polarimetry and NMR. In the depolymerization process, the effect of the reaction conditions and catalysts on optical purity of the lactide was examined with temperature having a significant effect. In addition, the degree of racemization increased with increasing molecular weight of the oligomeric PLA. The effects of temperature, time, solvent, and stirring speed (RPM) on the lactide purification process were examined in order to improve optical purity. Optical purity was maximized when separation was carried out at 25 °C. The optical purity of PLA was significantly affected by that of lactide used.     

Separation characteristics of lactic acid in reactive extraction and stripping

Lactic acid has recently been drawing much interest as a raw material for biodegradable polymer. Various extractants for lactic acid separation were tested and TOA (trioctylamine) was found the most effective one. Lactic acid was separated by reactive extraction with TOA dissolved in various diluents. The effect of temperature on the extraction efficiency was smaller than that of composition for the system studied in this work.     

Norsolorinic acid from a mutant strain ofAspergillus parasiticus

A mutant formed after UV irradiation of a potent aflatoxin producing strain ofAspergillus parasiticus elaborated 80% less aflatoxin than did the parent strain and produced an orange-red pigment. This new metabolite which represents 1% of the mycelial mass has been identified as 2-hexanoyl-1,3,6,8-tetrahydroxyanthraquinone (norsolorinic acid), mol wt 370, mp 256–257 C, and molecular formula C₂₀H₁₈O₇. Presented at the AOCS Meeting, New Orleans, April 1970. So. Utiliz. Res. Dev. Div. ARS, USDA. W. Utiliz. Res. Dev. Div., ARS, USDA.     

白血病K562细胞株中CD34~+细胞群的分离及其生物学特性

目的分离白血病K562细胞株中CD34+细胞群,并分析其生物学特征,为从干细胞角度治疗白血病提供实验依据。方法采用免疫磁性分选法分离K562细胞中CD34+细胞群,台盼蓝拒染法检测细胞活性;流式细胞术检测CD34+细胞比例及细胞周期;单细胞克隆培养检测CD34+细胞自我更新能力;RT-PCR法检测CD34+细胞分化相关指标促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulatingfactor,GM-CSF)基因mRNA的转录水平;并检测CD34+细胞耐药蛋白P-gp(P-glycoprotein)的表达。结果免疫磁性分选法可有效分离出CD34+细胞群,细胞活性为99%～100%;分离的CD34+细胞含量占细胞总数的78.5%～85.3%,细胞大部分处于静止状态,G0/G1期细胞比例达80%左右,显著高于分离前的K562细胞;CD34+细胞群具有形成混合集落的能力;与K562细胞相比,CD34+细胞EPO和GM-CSF基因mRNA的转录水平明显下降(P<0.01),P-gp表达阳性。结论成功从K562细胞株中分离了CD34+细胞群,其具有自我更新和多向分化的能力,表明其具有白血病干/祖细胞的生物学特点。