指数补料发酵提高鲁氏酵母β-1,3-葡聚糖酶产量

高耐盐鲁氏酵母A菌株(耐24%盐)10 L发酵罐产β-1,3-葡聚糖酶的过程中,葡萄糖(YEPD)是鲁氏酵母A生长和产酶的最适碳源,其发酵效率显著高于甘油(YEPG)和乙醇(YEPE),而乙酸钠的可利用性较差。YEPD批培养生长效率(生物量)、最大酶活力以及酶产率分别比YEPG和YEPE批培养提高了1.89%和29.88%、114%和19.65%以及188%和33%。与YEPD批培养相比,15~23 h开始指数流加YEPF培养基,达到最大生物量的周期缩短12 h,最大生物量提高19.29%,而且β-1,3葡聚糖酶几乎以对数增长的方式提前6 h合成到最大酶活力(44.99 U/m L),酶产率提高了76.86%,达到2.14 U/(m L·h),实现了指数补料发酵的目的。研究结果确定了有效提高鲁氏酵母A生物量和β-1,3-葡聚糖酶产量的指数补料模型,为高耐盐鲁氏酵母菌剂和β-1,3-葡聚糖酶产品有效生产以及其在高活性酿造功能食品行业的应用打下了基础。     

氮源对裂褶菌产裂褶多糖和β-1,3-葡聚糖酶的影响

本论文初步探讨了利用裂褶菌发酵体系所产的内切β-1,3-葡聚糖酶对发酵产生的裂褶多糖进行适度酶解,以获得分子量适中溶解度较好的裂褶多糖的可能性。以裂褶多糖产量和β-1,3-葡聚糖内切酶和总酶活为考察指标,采用刚果红琼脂染色法和摇瓶培养,从四株裂褶菌GIM5.42、GIM5.43、GIM5.44、Sc1中筛选出多糖产量和酶活都相对较高的菌株GIM5.43,多糖产量和酶活分别为2.29g/L与0.28 U/m L。在摇瓶中考察了氮源及其添加方式对裂褶菌菌体生长、裂褶多糖产率、β-1,3-葡聚糖酶的酶活及其影响规律。结果表明:菌体生长及其分泌胞外多糖和葡聚糖酶的最适酵母浸膏和氯化铵的添加时间和添加量是不同的。为了保证多糖产率,采用分批补加策略,初始酵母浸膏浓度1.00 g/L,发酵第6 d补加0.10 g/L酵母浸膏,多糖产量为4.16 g/L,比未优化提高了61.24%,总酶活为0.34 U/m L,提高了142.86%。     

发酵后期补加2种氮源对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影响

为探寻解决重要平台化合物1,3-丙二醇发酵后期菌体生长和1,3-丙二醇合成受限的方法,通过从菌体量、产物和关键酶活性及基因转录水平等方面,较全面地考察了发酵后期补加酵母膏和硫酸铵对克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)合成1,3-丙二醇的影响,结果为:添加两种氮源均有利于菌体生长;补加10 g/L酵母膏和硫酸铵,1,3-丙二醇产量由58.6 g/L分别提高到70.6 g/L和77.2 g/L;相对于酵母膏,硫酸铵对关键酶活性的增强更为明显,并使甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase,Dha D)在发酵后期始终维持较高水平,促进细胞生长和产物合成。此外,与补加酵母膏相比,补加硫酸铵后关键酶基因转录水平上调并不显著。表明硫酸铵主要通过直接激活关键酶活性促进细胞生长和产物合成。综上所述,发酵后期补加硫酸铵更利于1,3-丙二醇的生物合成,是提高发酵合成1,3-丙二醇水平的有效方式之一。     

耐热β葡聚糖酶发酵培养基的优化

本文利用响应面分析对耐热β-葡聚糖酶的发酵培养基进行优化,结果表明:最适发酵培养基组成为大麦粉43.48g/L、豆粉34.40g/L、Na Cl 2.4g/L、磷酸二氢钾2.4g/L和磷酸氢二钾12.5g/L;优化后的发酵培养基发酵产β-葡聚糖酶的量为(110±2.67)U/m L,比初始发酵培养基提高了11%。优化后的发酵培养基中的碳源和氮源是廉价的大麦粉和豆粉,大大降低了β-葡聚糖酶的生产成本,具有很好的实际应用价值。     

β-1,3-1,4葡聚糖酶在大肠杆菌中的高效分泌表达

在大肠杆菌中实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效分泌表达。将实验室自主开发的信号肽ff53与β-1,3-1,4-葡聚糖酶成熟肽基因(bgl)进行融合连接到p ET-28a(+)上;通过优化诱导表达条件,28℃、8 g/L乳糖诱导10 h,重组菌E.coli BL21/p ET-ff53-bgl发酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到1093 U/m L,与IPTG诱导的重组菌E.coli BL21/p ET-bgl(583 U/m L)相比,提高了0.87倍。本研究为高密度发酵制备该酶奠定了基础。     

黄曲霉产胞外β-1 ,3-1 ,4-葡聚糖酶的发酵条件优化

研究发现一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的黄曲霉菌株,优化了其产酶条件并考察了粗酶潜在的工业应用价值。依次采用单因素法和响应面分析法优化该菌发酵产酶条件,得到其优化产酶条件:麸皮19 g/L、磷酸氢二铵30g/L、吐温-60 21 g/L、NaCl 5 g/L、MgSO_4·7H_2O 0. 5 g/L、KH_2PO_40. 75 g/L、培养基初始pH值8. 0、培养温度38℃、培养时间6d。在此条件下,黄曲霉能够分泌的最高胞外β-1, 3-1,4-葡聚糖酶酶活达155.9 U/mL。水解研究发现,该酶能高效降解大麦粉和燕麦粉中的β-葡聚糖,并直接生成葡萄糖。这些结果表明,黄曲霉能高效分泌β-1,3-1,4-葡聚糖酶,且该酶具有较强的工业应用前景。     

两阶段pH和搅拌控制策略提高哈茨木霉产β-1，3-葡聚糖内切酶

为提高哈茨木霉(Trichoderma harzianum GIM 3.442)发酵生产β-1,3-葡聚糖内切酶的酶活E_(endo)及其内切酶酶活在总酶活中所占的比例E_(endo)/E_(total),在7 L发酵罐水平考察了不同p H和搅拌转速对菌体和产酶的影响。结果表明,单一p H或搅拌转速的优化不能使菌体生长和产物合成同时达到最优效果。通过分析不同p H和转速下发酵曲线和动力学参数,提出了两阶段p H和搅拌转速控制策略:在发酵前期(0~24 h)控制p H 7.0,搅拌转速100 r/min,发酵后期(24~168 h)控制p H 5.0,搅拌转速200 r/min。β-1,3-葡聚糖内切酶(E_(endo))、酶合成生产强度(Q_(E,endo))和E_(endo)/E_(total)分别达到了407.8 U/m L、3.09 U/(m L·h)和0.71,比优化前分别提高了320.0%、398.4%和65.1%。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆与表达

β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中.本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,经Sac I线性化后电击整合入毕赤酵母X-33基因组,构建重组酵母;经菌落PCR验证和摇瓶筛选,获得一株X-33/pPICZαA-bgl,甲醇诱导96h后,酶活力达308.5U/mL,经SDS-PAGE电泳,实际蛋白分子量约为33ku.β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃.     

高果糖浆废液杂糖组分分析及其作为毕赤酵母发酵碳源的资源化利用

废杂糖的资源化利用是高果糖浆生产行业迫切需要解决的问题。该研究首先通过高效液相、质谱和红外光谱分析,确定了杂糖成分为葡萄糖、果糖和聚合度为2~16的线性葡聚糖,包括葡萄糖480 g/L,果糖92 g/L,麦芽糖103.6 g/L,麦芽三糖36.8 g/L,总糖含量802.3 g/L。进一步使用2种常用的毕赤酵母宿主(P AOX1型毕赤酵母、P GAP型毕赤酵母)利用杂糖发酵生产内切β-1,3葡聚糖酶并与标准碳源(甘油和葡萄糖)作对比。结果表明,对于P AOX1型毕赤酵母,杂糖做碳源时细胞密度和酶活性与甘油相比均有所下降,最大生物量分别为59.1和82.0 g/L,最高酶活性分别为157.29和199.2 U/mL。对于P GAP型毕赤酵母,杂糖与葡萄糖的发酵效果相当,说明杂糖可以作为P GAP型毕赤酵母生产内切β-1,3葡聚糖酶的优质替代性碳源。     

源于木霉TP-24的β-1,3-葡聚糖酶提取纯化研究

为实现不溶性酵母β-1,3-葡聚糖的酶法改性增溶,对源于木霉TP-24的β-1,3-葡聚糖酶分离纯化进行研究.结果表明,用含有2?Cl2的pH5.0醋酸缓冲液浸提固态发酵曲180 min,所得粗酶液经2%活性炭脱色、(NH4)2SO4分段盐析、透析浓缩、Sephadex G-100层析分离,获得了高酶活的蛋白峰Ⅰ和杂蛋白峰Ⅱ.浓缩含酶组分进行SDS-PAGE电泳分析,酶蛋白呈单一谱带,分子量近似为54.56 ku,酶比活力为342.95 U/mg,相对于粗酶液纯化了28.67倍,酶的回收率为45.15%.     

酶处理纯化啤酒酵母β-1，3-葡聚糖的研究

采用酶处理对酵母残渣中β-1,3-葡聚糖进行纯化,研究了酶处理纯化的最佳工艺.结果表明:酵母残渣中添加208U/g底物的木瓜蛋白酶,在50℃、pH6.0条件下酶解8h,蛋白质去除率可达到62.82%,β-1.3-葡聚糖最终纯度为90.50%,得率为11.00%,经紫外光谱、薄层层析和性质分析为高纯度的β-1,3-葡聚糖,且回收到0.348g/L多肽、氨基酸含量丰富的蛋白水解液.     

发酵法提取燕麦β-葡聚糖的初步探索

研究了发酵法对提取燕麦麸皮中的β-葡聚糖的影响,比较了发酵液中β-葡聚糖的含量。结果显示,4种酵母菌发酵后发酵液中β-葡聚糖含量都比未经过发酵的燕麦麸培养液中β-葡聚糖含量明显增加。采用酵母发酵的方法提取燕麦β-葡聚糖的最优发酵条件:发酵培养基在灭菌前加蛋白酶、淀粉酶和糖化酶共同处理,所用菌种为黄酒酵母,发酵时间控制在48h;摇床参数为170r/min,28℃。     

β-葡聚糖酶发酵培养基的优化研究

为了对芽孢杆菌发酵产β-葡聚糖酶的培养基进行进一步的研究,以芽孢杆菌为发酵菌,通过单因素试验和三因素三水平正交试验法对芽孢杆菌的10L发酵罐发酵产酶培养基进行优化。实验结果表明:芽孢杆菌产β-葡聚糖酶的最优培养基为甘油含量6g/L、酵母粉含量24g/L和NaCl含量10g/L;发酵条件:接种量为10%、初始发酵pH值为7、培养温度为37℃、转速为350~950r/min、通风量为1vvm和发酵时间15h。经过3批发酵实验验证,最优条件下β-葡聚糖酶最高酶活可达3112U/mL。     

高盐稀态酱油发酵S3—2酵母基础发酵性能的研究

鲁氏酵母（S酵母）的耐盐能力抑制了其对高盐稀态酱油风味的改善作用。S3-2酵母是本试验室以S酵母为出发菌株,利用基因组重组技术构建的一株具有高耐盐度的酵母菌株。在YPD发酵培养基中对S3-2酵母进行基础发酵性能研究的结果表明,S3-2比S酵母具有更高的耐盐能力,S酵母能生长的最大盐度为19％,而S3-2酵母在含盐量高达21％的培养基中仍能够良好生长。在含盐量为18％的YPD发酵培养基中,S3-2酵母在提高醇类物质的种类和含量,对提高高盐稀态酱油风味具有重要的意义。     

树莓酵素中耐高渗酵母菌的分离鉴定及生长特性研究

从树莓酵素中分离酵母菌,通过形态学特征、生理生化指标及26S r DNA序列分析进行鉴定,并对其生长特性进行研究,以期为植物酵素食品生产提供酵母菌资源。鉴定结果表明:分离出的Y1、Y2、Y3三株菌形态学特征相似,且均可在高糖环境下生长,26S r DNA序列与鲁氏接合酵母的同源相似性均高于99%,确定Y1、Y2、Y3均为鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii,Z.rouxii);生长特性研究结果表明:当培养基初始葡萄糖含量为300、450、600、750 g/L时,该菌种均可生长,延滞期分别为12、12、36、60 h,葡萄糖初始含量为900 g/L,生长缓慢;当培养基初始pH为1.5和2.0时,菌种的生长受到抑制,当pH为2.5、3.0、3.5时,菌种可以生长,延滞期分别为96、48、48 h。鲁氏接合酵母为树莓酵素中的优势酵母,具有耐高糖、耐低pH等耐高渗特性。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在工业酿酒酵母表面的诱导展示表达研究

基于絮凝素FLO1基因片段为锚定序列,构建以诱导型GAL1启动子介导的表达载体YEP-GMPFAK,并实现以半乳糖为诱导剂,β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母表面的展示表达。酵母转化子发酵实验表明,在pH6.0、50℃培养条件下,经2%半乳糖诱导24 h,表面展示酶活达到最大值322.83 U/g细胞干重。酶学性质测定表明,展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有良好的热稳定性。     

响应面优化木霉TP-24固态发酵生产β-1,3-葡聚糖酶产酶条件

研究采用响应面法(RSM)对木霉TP-24固态发酵生产β-1,3-葡聚糖酶的培养基组成(碳源酵母粉、氮源NH4NO3和料水比)进行了优化。结果表明,采用以麸皮为基质、添加1.91%酵母粉、1.99%NH4NO3和15.79mL水的培养基中,接种木霉TP-24菌株于30℃发酵4d,β-1,3-葡聚糖酶活力可达到594.37U/g·ssc,比对照产酶水平提高了273.55%。     

产β-1,3-1,4-葡聚糖酶特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis CGX5-1发酵培养基的优化

采用响应面优化法对一株野生特基拉芽孢杆菌的发酵培养基进行优化,最终培养基各组分为:大麦粉68.4 g/L,玉米粉40 g/L,豆饼粉61.1 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO4·7H2O 0.1 g/L,CaCl20.1 g/L。用优化培养基在37℃摇瓶发酵52 h,β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活达到191.96 U/mL,是优化前产酶水平的1.91倍。     

木霉TP-24固态发酵生产β-1,3-葡聚糖酶产酶条件优化研究

采用响应面法（RSM）对木霉TP-24固态发酵生产β-1,3-葡聚糖酶的培养基组成（碳源酵母粉、氮源NH4NO3和料水比）进行了优化。结果表明,采用以麸皮为基质、添加到1．91％酵母粉、1．99％NH4NO3和15．79mL水的培养基中,接种木霉TP-24菌株于30℃发酵4d,β-1,3-葡聚糖酶活力可达到594．37U／g（单位干曲）,比对照产酶水平提高了273．55％。     

特基拉芽孢杆菌来源β-1,3-1,4-葡聚糖酶重组菌发酵培养基的优化

为了提高重组大肠杆菌(Escherichia coli BL21DE3)(pET-28a(+)-bgl)发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的能力,研究了发酵培养基中各类碳源及氮源的影响,并通过响应面分析法优化培养基各组分的含量。结果表明,甘油为最适碳源,酵母粉及胰蛋白胨为氮源。优化的培养基组成是:yeast extract终浓度为20 g/L,胰蛋白胨12.5 g/L,甘油14.1 mL/L,KH2PO42.17 g/L,K2HPO42.74 g/L。三角瓶发酵产β-葡聚糖酶酶活(2 978.2 U/mL),与初始培养基(1 671.9 U/mL)相比,提高了1.78倍。研究结果表明,发酵培养基的优化对重组大肠杆菌发酵生产工业酶具有重要作用。