食源性MRSA氨基糖苷类耐药基因多重PCR方法建立

目的:了解食源性金黄色葡萄球菌中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）及对氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素抗生素的耐药性情况,并建立快速检测鉴定金黄色葡萄球菌耐药性多重PCR方法。方法:对金黄色葡萄球菌进行增菌培养,并提取DNA作为模板,以nuc基因作为菌属鉴定基因,mec A基因作为MRSA检测基因,aac A-aph D及aph（3’）-Ⅲa基因作为耐氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素的检测目的基因,建立四重PCR检测方法并进行特异性及灵敏度评价;利用所建立的方法检测72株食品及食物中毒患者来源的金黄色葡萄球菌。结果:成功建立四重PCR检测方法,且72株金黄色葡萄球菌均有nuc基因检出,mec A基因与MRSA检测符合率达100%,aac A-aph D、aph（3’）-Ⅲa基因与庆大霉素、卡那霉素耐药菌株的符合率达95.12%。结论:本实验所建立的多重PCR方法灵敏度高、特异性好,可以快速检测出MRSA,并对氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素耐药菌株检测具有较高的准确率。      

食源性MRSA氨基糖苷类耐药基因多重PCR方法建立

目的:了解食源性金黄色葡萄球菌中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)及对氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素抗生素的耐药性情况,并建立快速检测鉴定金黄色葡萄球菌耐药性多重PCR方法。方法:对金黄色葡萄球菌进行增菌培养,并提取DNA作为模板,以nuc基因作为菌属鉴定基因,mec A基因作为MRSA检测基因,aac A-aph D及aph(3')-Ⅲa基因作为耐氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素的检测目的基因,建立四重PCR检测方法并进行特异性及灵敏度评价;利用所建立的方法检测72株食品及食物中毒患者来源的金黄色葡萄球菌。结果:成功建立四重PCR检测方法,且72株金黄色葡萄球菌均有nuc基因检出,mec A基因与MRSA检测符合率达100%,aac A-aph D、aph(3')-Ⅲa基因与庆大霉素、卡那霉素耐药菌株的符合率达95.12%。结论:本实验所建立的多重PCR方法灵敏度高、特异性好,可以快速检测出MRSA,并对氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素耐药菌株检测具有较高的准确率。     

多重荧光PCR快速检测食源性致病菌的研究进展

食源性疾病多由食源性致病菌引发,威胁个人健康及全球食品安全,因此寻找有效、可靠的食源性致病菌高通量检测方法对于确保食品安全具有重要意义。鉴于传统检测技术耗时长、效率低等问题,PCR等分子生物学技术应用于食用致病菌检测领域越来越广泛,本文在普及食用性致病菌知识的基础上,着重对多重荧光PCR技术原理及在食用性致病菌检测的应用进展进行综述,以期为控制由食用性致病菌引发的食品安全隐患提供理论参考。     

干燥型荧光PCR试剂盒检测食源性致病菌研究

目的研究干燥型荧光PCR试剂盒检测副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌3种食源性致病菌的灵敏度、特异性和检测人工污染样品情况。方法目标菌和非目标菌接种至血平板, 36℃培养过夜,目标菌比浊至0.5 McF(麦氏单位), 10倍连续稀释后提取DNA,进行灵敏度研究;非目标菌直接提取DNA后检测,进行特异性研究;用高、中、低3个浓度目标菌液人工污染食品样品,按国标方法培养后用干燥型荧光PCR试剂盒检测。结果副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌的最低检测浓度分别为140、380和7900 CFU/mL。3种目标菌人工污染食品样品的最低检测浓度分别为1.2 CFU/25 g、5.1CFU/25 g、10 CFU/25 g。每种试剂盒仅对目标菌株的检测结果呈阳性,非目标菌株均呈阴性。结论新型干燥型荧光PCR检测试剂盒具有较好的灵敏度和良好的特异性,适用于食品中副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌的检测。     

食源性致病菌通用型多重荧光PCR快速检测体系的建立

以两种食源性致病菌(沙门氏菌、单增李斯特菌)为模板,对通用型多重荧光PCR快速检测体系进行了研究。建立的通用型多重荧光PCR反应体系为:25μL反应液中,Tris-HCl为50mmol/L、pH值为8.8、KCl15mmol/L、(NH4)2SO4为8mmol/L、Mg2+为3mmol/L、dNTP为1.0mmol/L、引物和探针的终浓度分别为1μmol/L和0.5μmol/L、加入0.5μLDMSO,2.5U/份的Taq酶与等量的Taq酶抗体。     

2种食源性致病菌多重荧光PCR检测方法的建立

文章旨在建立一种可同时快速检测食品中沙门氏菌和副溶血弧菌的TaqMan双重荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)检测方法。分别针对沙门氏菌的inv A基因和副溶血弧菌的tlh基因序列的保守片段,设计了特异性检测引物和探针,并优化其使用浓度及反应退火温度,建立双重荧光定量PCR检测体系,并对方法的灵敏度、特异性及稳定性进行评估。结果显示：建立的双重荧光定量PCR检测法可特异性扩增沙门氏菌和副溶血弧菌,其他菌株无扩增。沙门氏菌检测灵敏度最低检测值可达1 copies/μL,副溶血弧菌检测灵敏度为10 copies/μL。批内批间变异系数均<2%,重复性和稳定性较好,与传统方法检测结果一致,检测时长大幅度缩短。综上表明,建立的双重荧光PCR检测方法能够快速、准确地检测出食品中沙门氏菌和副溶血弧菌,为食品中食源性致病菌的快速检测提供技术支持。     

金黄色葡萄球菌实时荧光PCR快速检测方法的建立

为建立检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)的快速检测方法,以SA Sa442基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光PCR快速检测SA的方法。结果显示,对16株试验菌株进行荧光PCR检测,只有SA检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为7.5 CFU/m L,利用该检测方法对采集的175份样品进行检测,共计检出5份SA阳性样品,与国标法(GB 4789.10—2010)检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

食品中副溶血性弧菌toxR和tdh基因双色荧光PCR检测方法的建立

目的 建立对副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）特异性检测toxR（跨膜转录激活蛋白）基因和tdh（热稳定性直接溶血素）毒力基因的Taqman探针双色荧光PCR检测方法。方法 根据副溶血性弧菌toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立Taqman探针双色荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度试验;对副溶血性弧菌分离菌株实施检测,了解其tdh基因和tdh基因分布情况。结果 结果表明,副溶血性弧菌标准菌株和3株从食物中毒患者中分离获得的分离株均出现toxR基因和tdh扩增曲线,而溶藻弧菌、单增李斯特菌等31株弧菌属其他菌株和肠杆菌科的菌株未见扩增曲线。从食品中分离的37株副溶血性弧菌分离株均未携带tdh毒力基因。副溶血性弧菌检测灵敏度可达到3.6×102 cfu/mL。结论 该方法可用于同时检测食品中副溶血性弧菌的特异性和毒力基因。     

实时荧光定量PCR技术在食源性致病菌检测中的应用

实时荧光定量PCR技术作为一种高效的微生物定量检测法,在食品工业中具有广泛的应用前景。本文综述了实时荧光定量PCR技术检测原理,及其在食源性致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌和副溶血性弧菌检测中的应用。     

实时荧光定量PCR技术在金黄色葡萄球菌检测中的应用

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是主要的食源性致病菌之一。实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术是近年来广泛应用于食源性致病菌的快速检测方法,具有特异性强、灵敏度高等特点。本文综述了Real-time PCR技术原理、分类及其在检测食品中金黄色葡萄球菌的应用,并对其应用前景进行了展望。      

鉴定金黄色葡萄球菌的多重PCR方法

建立了一种快速鉴定和鉴别金黄色葡萄球菌的多重PCR方法。利用金黄色葡萄球菌的特异基因、耐甲氧西林基因和4种肠毒素基因nuc、mecA和sea、sec、sed、see建立6重PCR反应体系,并对PCR体系,引物浓度进行优化。6对PCR引物均能特异地扩出相应的目的基因。对47株金黄色葡萄球菌的检测结果与应用单重PCR鉴定结果完全一致。实验所建立的多重PCR方法能在一个反应体系中鉴定和鉴别金黄色葡萄球菌,为食品中金黄色葡萄球菌的快速检测提供了一种有效的检测手段。     

多重实时荧光定量PCR快速检测婴幼儿奶粉中沙门氏菌、克罗诺杆菌和金黄色葡萄球菌

目的建立多重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR,multiplex qPCR)快速检测奶粉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和克罗诺杆菌3种常见致病菌的方法。方法筛选目标菌株的特异性引物与探针,优化反应体系,建立稳定的多重q PCR反应体系。通过阳性菌株加标的方式验证体系的特异性,并确定人工污染奶粉的检出限。结果各对引物探针对目标菌株均能扩增,多重实时荧光PCR未发现交叉反应,对17株非目标菌进行检测均未检出,人工污染奶粉中克罗诺杆菌和沙门氏菌的检出限均为10~3 CFU/mL,金黄色葡萄球菌的检出限为10~4 CFU/mL。结论本研究方法可实现婴幼儿奶粉样品中3种致病菌qPCR高效率检测。     

Taqman探针实时PCR检测金黄色葡萄球菌的研究

建立了Taqman探针实时PCR方法,针对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。研究所设计的引物具有良好的特异性,而且Taqman探针实时PCR方法检测sea基因的灵敏度高,最低检出限为69 fg,并且该方法可在8 h内完成人工污染乳中金黄色葡萄球菌的检测,最低检出限为83 cfu/mL。研究所建立的方法具有特异性强、灵敏性高及操作简便等优点,适宜于牛乳中金黄色葡萄球菌污染的调查及监测。     

多重PCR检测金黄色葡萄球菌六型肠毒素基因的研究

目的:为了建立一种简单、快速检测金黄色葡萄球菌六型肠毒素基因的多重PCR方法。方法:根据相关文献和Genebank报道的编码金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E、H的基因序列,选择合成了6对特异性引物,建立多重PCR体系,并对反应条件进行了优化。结果:6对引物能同时特异地扩增出120、478、257、319、170、375bp的目的片段,表明6对引物具有良好的特异性。结论:成功地建立了一种同时检测金黄色葡萄球菌六型肠毒素基因的多重PCR方法,在金黄色葡萄球菌肠毒素快速筛查方面具有良好的应用前景。     

云南省食源性金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳分型分析

目的采用脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)方法分析云南省2013～2015年食源性金黄色葡萄球菌分子分型带型,初步建立金黄色葡萄球菌PFGE分型的数据库。方法用限制性内切酶Smal I酶切113株金黄色葡萄球菌染色体DNA以进行PFGE分析,并利用BioNumerics软件对分离株的指纹图谱进行聚类分析。结果 113株食源性金黄色葡萄球菌的PFGE图谱的相似性系数在56.67%～100%之间,经聚类分析得到89个PFGE型别。结论建立云南省食源性金黄色葡萄球菌PFGE分型数据库,PFGE带型呈现多样性,对今后云南省金黄色葡萄球菌引起食物中毒的诊断和溯源工作有重要意义。     

GNM C7-8实时荧光定量PCR同时快速检测8种食源性致病菌

目的基于GNM C7-8实时荧光定量PCR系统实现对8种常见食源性病原菌的同时快速检测。方法以建立的8种常见食源性致病菌的基于内参系统的实时荧光PCR检测方法为参照,基于GNM C7-8实时荧光定量PCR系统,对上述病原菌进行同一时间点和不同时间点的同时快速检测,并将检测结果同常见的ABI7500和罗氏荧光定量PCR仪检测结果进行比较。结果基于八模块设计的GNM C7-8实时荧光定量PCR系统能够在同一时间点和不同时间点启动运行,并实现对8种病原菌的同时快速检测;不同病原体的检测体系独立运行,互不干扰,不易发生交叉污染;与其他2种荧光定量PCR仪相比,扩增结果一致,但是完成检测所需时间更短。结论对于食物中毒和疫病爆发等突发性重大公共卫生事件的应急处置,GNM C7-8实时荧光定量PCR系统将可以提供强有力的设备支持。     

黑龙江耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药及分子分型研究

目的了解黑龙江省健康人与屠宰场猪耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)携带情况,及其耐药和分子分型情况。方法参照黑龙江省金黄色葡萄球菌专项监测方案,对分离的金黄色葡萄球菌进行药物敏感性检测筛选MRSA,对MRSA进行spa、MLST和SCCmec基因分型,同时检测pvl基因。结果 1500份健康人样本分离出257株金黄色葡萄球菌(17.13%, 257/1500), 500份猪样本分离出149株金黄色葡萄球菌(29.8%, 149/500)。所有菌株对万古霉素、替考拉宁和利奈唑烷均敏感,对红霉素和克林霉素耐药率较高。MLST分型结果为ST9型, 1株未鉴定出型别。spa分型为t899和t2922, t899为主要型别(83%, 29/35)。SCCmec分型结果为IVb型, pvl基因均为阴性。结论黑龙江省健康人MRSA携带率比例较低,屠宰场猪携带一定程度MRSA,且猪源金黄色葡萄球菌耐药情况较重,应控制养殖动物抗生素的使用。     

食品中金黄色葡萄球菌PCR-ELISA检测技术建立

针对食品中金黄色葡萄球菌检测,选取金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因作为靶标,利用地高辛标记引物扩增的PCR产物与生物素标记的探针杂交,然后与ELISA平板上的链霉素杂交,通过抗地高辛抗体显色建立PCR-ELISA检测技术。应用该方法检测人工污染牛奶中金黄色葡萄球菌,同时将大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌等常见食源性致病菌作为阴性对照。结果显示,金黄色葡萄球菌的纯培养物以及人工污染金黄色葡萄球菌牛奶,金黄色葡萄球菌为阳性,其他对照菌为阴性,两者PCR-ELISA检测敏感性均为10¹CFU/m L,比普通PCR检测的敏感性（10³CFU/m L）高100倍。因此,该研究建立的PCR-ELISA方法具有良好的特异性与敏感性,能够特异、敏感、准确地检测牛奶中的金黄色葡萄球菌,为食品中金黄色葡萄菌的快速鉴定、风险评估与有效监测提供重要技术手段。      

食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因型分布研究

目的 采用PCR法扩增食源性金黄色葡萄球菌中肠毒素基因以了解该菌肠毒素基因携带情况,比较食物中毒和食品监测来源菌株中肠毒素基因检出率差异.方法 合成sea、seb、sec、sed和see五种肠毒素基因特异性引物,用常规PCR方法扩增食物中毒和食品监测来源菌株中各自肠毒素基因,同时采用mini-VIDAS检测食物中毒来源菌株中肠毒素.结果 110株菌株中有30株检出肠毒素基因,检出率为27.3％,肠毒素基因阳性菌株均只检出1种肠毒素基因.其中来自2起食物中毒的14株菌株均检出seb型肠毒素和相关基因,检出率为100％.来源于食品监测样本的96株菌株中有16株检出肠毒素基因,检出率为16.7％,包括sea型4株、seb型2株、sec型4株、sed型6株.结论 在宁波市食品监测中所分离的金黄色葡萄球菌所携带的肠毒素基因主要有sea、seb、sec和sed四型,而seb型肠毒素是引起金黄色葡萄球菌肠毒素所致食物中毒的主要因素.